研究課題
本研究では、ヒト末梢血T細胞のprogrammed death-1(PD-1)遺伝子をclustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9(CRISPR/Cas9)を用いたゲノム編集技術により破壊し、かつ、レンチウイルスによる遺伝子導入技術を用いて膠芽腫に発現するがん変異抗原epidermal growth factor receptor, transcript variant III(EGFRvIII)特異的chimeric antigen receptor (CAR)を発現させ、PD-1を破壊したEGFRvIII特異的なCAR-T細胞(PD-1-KO-EvCAR-T)を誘導することを目標としている。誘導したPD-1-KO-EvCAR-Tについては、EvCAR、PD-1ならびにその他の細胞表面レセプターの発現、PD-1遺伝子の破壊効率、PD-1遺伝子破壊領域のDNA配列、in vitroにおける膠芽腫細胞に対する抗がん効果を評価する予定である。平成30年度は、Cas9を搭載したsingle-guide RNA(sgRNA)発現ベクターにPD-1遺伝子に対するCRISPR配列を設計・構築した。培養細胞系（HEK293T細胞）に構築した遺伝子ベクターを導入しPD-1の標的遺伝子領域を破壊できたことをPCR法とresolvase反応で確認した。平成31年度(令和1年度)は、PD-1-KO-EvCAR-Tの誘導とその特性解析（EvCAR、PD-1、その他の細胞表面レセプターの発現、膠芽腫細胞に対する増殖抑制試験）を行う予定である。誘導したPD-1-KO-CAR-TについてPD-1遺伝子の破壊領域のDNA配列解析も実施する予定である。
2: おおむね順調に進展している
Cas9を搭載したsingle-guide RNA(sgRNA)発現ベクターにPD-1遺伝子に対するCRISPR配列を設計・構築した。HEK293T細胞に構築した遺伝子ベクターを導入し、PD-1の標的遺伝子領域が破壊できたことをPCR法ならびにresolvase反応を用いて確認した。
当初の計画通りに、PD-1遺伝子破壊EGFRvIII特異的CAR-T細胞の誘導とその特性解析を実施する予定である。
平成30年度の研究進行状況から60,074円の次年度使用額が残った。平成31年度(令和1年度)に必要な物品の購入に使用する予定である。
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すべて 雑誌論文 (4件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (4件) (うち国際学会 3件)
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