PD-1遺伝子破壊EGFRvIII特異的CAR-T細胞による膠芽腫治療法の開発

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18K16567
• 研究機関: 奈良県立医科大学
• 研究代表者: 中澤 務 奈良県立医科大学, 医学部, 研究員 (00772500)
• 研究期間 (年度): 2018-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: CAR / PD-1 / CRISPR/Cas9 / EGFRｖIII

研究実績の概要

本研究では、ヒト末梢血T細胞のprogrammed death-1(PD-1)遺伝子をclustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9(CRISPR/Cas9)を用いたゲノム編集技術により破壊し、かつ、レンチウイルスによる遺伝子導入技術を用いて膠芽腫に発現するがん変異抗原epidermal growth factor receptor, transcript　variant III(EGFRvIII)特異的chimeric antigen receptor (CAR)を発現させ、PD-1を破壊したEGFRvIII特異的なCAR-T細胞(PD-1-KO-EvCAR-T)を誘導することを目標としている。誘導したPD-1-KO-EvCAR-Tについては、EvCAR、PD-1ならびにその他の細胞表面レセプターの発現、PD-1遺伝子の破壊効率、PD-1遺伝子破壊領域のDNA配列、in vitroにおける膠芽腫細胞に対する抗がん効果を評価する。
平成30年度は、Cas9を搭載したsingle-guide RNA(sgRNA)発現ベクターにPD-1遺伝子に対するCRISPR配列を設計・構築した。培養細胞系（HEK293T細胞）に構築した遺伝子ベクターを導入しPD-1の標的遺伝子領域を破壊できたことをPCR法とT7 Endonuclease Iによる反応でで確認した。
令和1年度は、PD-1-KO-EvCAR-Tの誘導とその特性解析（EvCAR、PD-1、その他の細胞表面レセプターの発現、膠芽腫細胞に対する増殖抑制試験）を行った。さらに、誘導したPD-1-KO-CAR-TのPD-1遺伝子破壊領域のDNA配列解析および作製したsgRNAのoff-target効果についても解析した。

研究成果

• [雑誌論文] Effect of CRISPR/Cas9-Mediated PD-1-Disrupted Primary Human Third-Generation CAR-T Cells Targeting EGFRvIII on In Vitro Human Glioblastoma Cell Growth (2020)
  • 著者名/発表者名: Nakazawa T, Natsume A, Nishimura F, Morimoto T, Matsuda R, Nakamura M, Yamada S, Nakagawa I, Motoyama Y, Park YS, Tsujimura T, Wakabayashi T, Nakase H.
  • 雑誌名: Cells 巻: 16 ページ: 998
  • DOI: https://doi.org/10.3390/cells9040998
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Characterization of a novel type NK cell line KHYG-1 carrying EGFRvIII-specific CAR in glioblastoma cells (2020)
  • 著者名/発表者名: Morimoto T, Nakazawa T, Natsume A, Nishimura F, Matsuda R, Murakami T, Nakagawa I, Motoyama Y, Park YS, Tsujimura T, Wakabayashi T, Nakase H
  • 学会等名: American Association of Immunology (AAI) 2020
  • 国際学会
• [学会発表] Effect of CRISPR/Cas9-mediated PD-1-disrupted primary human third-generation CAR-T cells targeting EGFRvIII on human glioblastoma cell growth (2020)
  • 著者名/発表者名: Nakazawa T, Natsume A, Nishimura F, Matsuda R, Murakami T, Nakagawa I, Motoyama Y, Park YS, Tsujimura T, Wakabayashi T, Nakase H
  • 学会等名: American Association of Immunology (AAI) 2020
  • 国際学会
• [学会発表] 膠芽腫に対する高純度NK細胞と免疫チェックポイント阻害薬併用による抗腫瘍効果の検討 (2019)
  • 著者名/発表者名: 至田洋一、中澤務、中村光利、辻村貴弘、森本尭之、田中祥貴、村上敏春、尾本幸治、松田良介、中川一郎、西村文彦、本山靖、朴永銖、中瀬裕之
  • 学会等名: 第20回日本分子脳神経外科学会
• [学会発表] Establishment of highly purified human natural killer cells and evaluation of their antitumor activity on glioblastoma (2019)
  • 著者名/発表者名: 松田良介、中澤務、田中祥貴、至田洋一、中村光利、西村文彦、村上敏春、中川一郎、本山靖、辻村貴弘、中瀬裕之
  • 学会等名: 第23回日本がん免疫学会総会