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光感受性遺伝子であるChR2遺伝子およびeNpHR3.0遺伝子導入神経幹細胞の作成のため、当初はエレクトロポレーションによる導入を想定していた。しかし、ハイコピーのプラスミドのエレクトロポレーションによる導入効率が悪く、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入に切り替えた。
そのため、まずChR2遺伝子およびeNpHR3.0遺伝子のプラスミドを用いてウイルスベクターの作成を行った。ChR2についてはCAGプロモーターと結合させレンチウイルスベクターCSⅡ-CAG-ChR2-mVenus作成した。eNpHR3.0についてはCSⅡ-CAG-MCS-WPREとpBSK-eNpHR3.0-mRuby2から、目的のプラスミドであるCSⅡ-CAG-eNpHR3.0-mRuby2を作成した。
しかし、RFP IgG抗体のeNpHR3.0-mRuby2の認識が不良であったため、FLAGを挿入して認識できるように新たにCS2-CAG-eNpHR3.0-FLAG-mRuby2-WPREを作成することとなった。
pCAG-eNpHR3.0-FLAG-mRuby2とCS2-CAG-eNpHR3.0-mRuby2を結合させてCSⅡ-CAG-eNpHR3.0-FLAG-mRuby2を作成した。これらのプラスミドを神経幹細胞への導入に先立って、まずは汎用されているHEK293TFT細胞にtransfectionして培養した。免疫染色、ウェスタンブロッティングにて目的遺伝子の導入を確認した。FLAG抗体による遺伝子導入も確認された。蛍光性や膜移行性は特に問題はないと考えられる。
今後、これらのレンチウイルスベクターCSⅡ-CAG-ChR2-mVenusおよびCSⅡ-CAG-eNpHR3.0-FLAG-mRuby2を用いてHEK293FT細胞にtransfectionしてレンチウイルスの作成を行っていく。
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