| 研究課題/領域番号 |
18K16638
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター) |
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研究代表者 |
津野 宏隆 独立行政法人国立病院機構(相模原病院臨床研究センター), リウマチ性疾患研究室, 医師 (90792135)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 変形性関節症 / エクソソーム / 関節リウマチ / 関節炎 / 関節液 / miRNA |
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| 研究実績の概要 |
変形性関節症（osteoarthritis, 以下OA）については多くの疫学研究によって滑膜の変化と痛みなどの症状、さらに軟骨の変性・消失の進行が密接に関連していることが示されている。この知見に基づけば、滑膜において痛みを生じるような変化が生じると、その際に何らかの因子が産生され、その因子が関節液を介して軟骨基質の変性・消失を引き起こしている可能性が考えられる。本研究の目的は関節液中に存在するエクソソームに着目し、進行が認められる膝OA（Progressive, 以下P-OA）、進行が認められない膝OA（Non-progressive, 以下NP-OA）、及び関節リウマチ（rheumatoid arthritis, 以下RA）の３群について関節液中のエクソソームを比較解析することでOAにおける軟骨変性のメカニズムを明らかにすることであった。本研究ではOAにおける軟骨変性と滑膜病変の関連をエクソソームという比較的新しい生命現象をキーワードとして、OAの進行例と非進行例、さらにRAとの比較によって解明しようとするもので、OAの症例間の進行の違いに着目する点にも研究の特徴がある。研究代表者は研究第二年度までに関節液中のエクソソームのmiRNAのqPCRパネルを用いて半網羅的な定量解析を行い、OAにおける軟骨変性に関与する可能性のあるmiRNAを選択した。さらに滑膜組織よりmRNAとmiRNAを同時に抽出し、選択されたmiRNAとその標的となりうる因子の遺伝子発現の関連をqPCRで検討することによって選択されたmiRNAが滑膜組織で実際にどのような意義を持ちうるかを明らかにしつつある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究初年度から第二年度にかけて、P-OAとNP-OAの関節液検体について関節液中のエクソソームを回収してそこからmiRNAを抽出し、これをPCRパネル（miScript miRNA PCR Array、Qiagen社）で解析して関節液中に存在する主要なmiRNAの半網羅的・定量的解析を行った。さらにそれらのmiRNAをP-OAとNP-OAの間で比較することによってOA関節液中に存在し、二群の間に濃度の有意差があり、かつ既知の情報に照らして軟骨の変性に関与する可能性のあるmiRNA（以下、候補miRNA）を絞り込んだ。この結果5つの候補miRNA（miR-21, miR-128, miR-146b, miR-218a, miR-302d）が決定された。
当初の予定では、これらの候補miRNAについてLNAを導入したオリゴヌクレオチドを合成し、これを末期OA膝関節の軟骨組織から調整した一次培養関節軟骨細胞に導入して細胞の挙動の変化を検討する予定であったが、実験に要する経費の点でこの実験は実施困難となった。そのため計画を修正し、関節液中に見出された候補miRNAが軟骨、滑膜いずれの組織に由来し、それぞれの組織においてどのような意義を持ちうるのかを検討することにした。具体的には32例のOA関節から採取した軟骨組織、滑膜組織それぞれからmRNA、miRNAを抽出し、これらを定量的に解析することで候補miRNAがどちらの組織で発現しているかを明らかにするとともに、それぞれの組織において候補miRNAとそれにより発現が制御されうるRNAの発現レベルの相関を検討することによってその組織で候補miRNAがどのような意義を持つかを推定することとした。さらに候補miRNAがRAの病態にも関連するかを検討するために、RA群の関節液検体についても候補miRNAの濃度を検討した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究は当初2年の研究期間を予定していたが、解析に予想以上に時間を要したため、研究期間を3年に延長することを願い出た。3年目は上述の滑膜組織の解析を継続する予定である。OAの滑膜、軟骨組織における候補miRNAとRNAの発現レベルの解析は、今のところまだ予定の半分程度しか解析を終えておらず、今年度の早い時期に解析を終了する予定である。また上述のRA群の解析については現時点ではまだ行えておらず、本年度はやはり年度の早い時期にこの解析を完了するとともにP-OA、NP-OA、RAの3群間についての比較検討解析を行う。なおRA群については全例を一つの群として解析するほか、疾患活動性の高い膝関節リウマチと疾患活動性の低い膝関節リウマチに分類してのサブ解析も行う予定である。本年度はこれらの解析を終え、さらにそこから得られた知見を学会発表、論文などにより公表することを予定している。
本研究では当初予定していたLNAを導入したオリゴヌクレオチドによる実験は行えなかった。さらに当初は関節液中エクソソームに含まれるタンパクについてもLC-MS/MSを用いた解析を予定していたが、それも研究経費の問題から行うことができていない。このうちオリゴヌクレオチドの導入による細胞の機能変化の検討は、本研究において見出された候補miRNAが軟骨や滑膜組織においてどのような意義を持つのかを知るうえで必要不可欠な実験と考える。また、関節液中のエクソソームに含まれるタンパクについても軟骨細胞の挙動に影響を与えるとする報告も見られ、やはり解析を行う価値のある検討と考えられる。これら未施行の研究課題については今後新たに研究経費を獲得して行う予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究第二年度までに行われる予定であった実験が完了できず、その結果実験結果の解析も不十分な状態であるため研究期間の延長を願い出たが、第三年度は第二年度で終了できなかった実験を行うとともに解析を完了し、結果を学会や論文として公表する予定である。昨年度までに解析に必要な試薬類はほぼ購入を終えており、実験関連の支出については次年度使用する予定はないが、学会での成果発表や論文の作成、投稿には相応の費用を要す見込みであり、そのための研究経費の支出を希望するものである。
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