| 研究課題/領域番号 |
18K16639
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| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪国際がんセンター(研究所) |
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研究代表者 |
田宮 大也 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪国際がんセンター(研究所), その他部局等, 整形外科 医長 (70811686)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 淡明細胞肉腫 / SHARPIN / PRMT5 |
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| 研究実績の概要 |
淡明細胞肉腫細胞株においてSHARPINおよびPRMT5の発現量をウエスタンブロットで検索したところHDF(human dermal fibroblast)と比較してSHARPINの発現量が5つの淡明細胞肉腫細胞株において増加していた。しかしながらPRMT5の発現量はほとんど差がなかった。今後SHARPINの発現量の増加がPRMT5の活性を増加させているかに関してウエスタンブロットなどで測定する予定である。またウエスタンブロットとqPCRでの実験系は確立したので臨床サンプルを使用してclear cell sarcomaおよびangiomatoid fibrous histiocytoma間でのSHARPINおよびPRMT5発現量の比較を行う予定である。
SHARPIN発現が亢進していた細胞株においてSHARPINおよびPRMT5のノックダウンを行うため、レンチウイルスは作成終了し現在stable cell lineを作成中である。今後SHARPINおよびPRMT5ノックダウンによる細胞増殖への影響をcolony formationなどを用いて評価する。またSOX10, MITF発現をウエスタンブロットおよびqPCRにて測定する。
Hela細胞にEWS-ATF1を導入し免疫染色を行ったところEWS-ATF1は主に核に局在し細胞質での存在は明らかではなかった。細胞株を変更し、現在はEWS-ATF1をレンチウイルス感染により淡明細胞肉腫に発現させ局在をV5tagを用いて確認する。こちらもstable cell lineを作成中である。まずはV5による細胞免疫染色にて細胞内局在を明らかにし、結合タンパク同定のため免疫沈降および質量分析へと進める前準備は完成しつつある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
SHARPINおよびPRMT5の発現量はすでに測定できている。またEWS-ATF1の過剰発現株もほぼ作成済みであり、結合タンパク同定のため免疫沈降、質量分析へと進める準備が進行している。また今後臨床サンプルでのclear cell sarcomaおよびangiomatoid fibrous histiocytoma間でSHARPIN, PRMT5発現量を比較する準備もできており予定通りの進行と考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記通り進捗状況は順調と考えているが、今後の実験によりEWS-ATF1が核への局在のみとなった場合には細胞質での働きを解析する意味は少なくなるため研究の進め方には検討を要する。核内であっても免疫沈降し質量分析から結合タンパクを同定することは可能であるがすでに過去の論文でmicroarrayなど網羅的な解析はなされており、労力に見合った結果にならない可能性がある。この場合にはSHARPINおよびPRMT5の解析を中心に進めることを考えている。Preliminaryな実験ではclear cell sarcoma細胞株においてPRMT5阻害剤が増殖抑制および細胞死を誘導しているというデータもあるのでSHARPINおよびPRMT5のノックダウン細胞株でより詳細な評価を行う予定である。
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