| 研究課題/領域番号 |
18K16647
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
宇土 美於 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 非常勤講師 (50783495)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 間葉系幹細胞治療 |
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| 研究実績の概要 |
前十字靭帯（ＡＣＬ）損傷は、若い運動選手におおく、傷害が治療されないままであれば、関節軟骨損傷が発生します。骨髄刺激、自家軟骨移植および自己軟骨細胞移植などの治療法がある。間葉系幹細胞治療は、軟骨損傷の修復を改善する新規治療法として期待されている。滑膜ＭＳＣが他の組織からのＭＳＣと比較して優れた軟骨形成能を有する。本研究の目的は、MSCsの関節内投与を行い、疼痛評価、関節内変化の評価をおこなった。
方法：オスのウィスターラットを使用した。 ＡＣＬの切断（ＡＣＬＴ）後１、２、３週目にラット滑膜ＭＳＣ1*１０６個を膝関節に注射した。 ＰＢＳ群を対照群とした。 下肢痛を調べるために疼痛関連行動試験を行い、ACLTの12週後に組織学的検査を行った。巨視的観察をおこなった。組織学的評価はOARSIスコアリングシステムを用いて行った。
結果：肉眼的観察により、ACLT後にMSCが注射された場合、12週での内側脛骨プラトーおよび内側大腿顆の変性が有意に軽減されることが示された。 ＯＡＲＳＩスコアが１２週で内側脛骨プラトーおよび内側大腿顆の両方において滑膜ＭＳＣ注射群において有意に改善されたので、組織学的評価もこの結果を支持した。 PBS群における体重負荷分布は、手術後6週間後に MSC群よりコントロールが低かった。
考察：肉眼的および組織学的評価（ＯＡＲＳＩスコア）は、ラットにおけるＡＣＬＴ後のMSCｓ細胞が関節軟骨変性の重症度を軽減するのに有効であることを示した。さらに、本実験では、MSCの注射による膝の痛みの軽減に有意な効果が観察された。これが関節軟骨変性の減少、MSCの抗炎症作用、および/または疼痛軽減に対するMSCの未知の機能によるものである可能性があることは依然として不明であり、膝の疼痛軽減に対するMSC移植の影響を分析するためにさらなる研究が必要である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度の研究としてOAモデルに対し、MSCsを関節内に、12週における所見を下記の視点で評価・検討することを挙げていた。
A) MSCsを炎症の生じている膝関節内に投与すると軟骨変性はどうなるか。関節内変化の評価として肉眼的所見、組織所見から軟骨変性を評価し、MSCs投与の時期とその有効性について統計学的解析を行う。肉眼的所見を評価する。その後、パラフィン切片標本を作成し、SaO染色
を行い、OARSI scoreを用いて評価し、統計学的解析を行う。B) MSCsを炎症の生じている関節内に投与すると痛みはどうなるか。疼痛評価として行動解析（incapacitance test, ホットプレート法、von Frey test）を行う。incapacitance testは荷重分析評価法の一つで、左右の荷重を計測し、左右の割合を解析する。疼痛がある下肢では荷重する割合が減少する。無拘束の状態での測定が可能で、侵害刺激への反応を見る行動解析とは違い、平常時の疼痛が測定できる。
C) 神経組織所見：脊髄、傍脊髄神経節（DRG）の免疫組織学的評価。膝関節内および膝関節周囲で生じる疼痛は末梢神経からDRGを経由し上行し、脊髄後角へと入る。脊髄後角から対側の白質を上行し、脳へ達する。逆行性トレーサーであるFluoro Goldを関節内に注射し、注射後1週間で還流固定を行い、脊髄、DRGを摘出し、凍結標本にして、スライスし切片とする。これを蛍光顕微鏡下で観察すると疼痛に対応した髄節、DRGを特定できる。またFG陽性の脊髄、DRG標本をGFAP、CGRPで免疫染色を行い、陽性細胞の数により評価する。これらのDRGでの結果
と膝関節のSubstance P, CGRPの陽性細胞数との関係を検討する。
このうち実験１，２は終了したが、実験３に関して免疫染色がうまくいかず時間をようしている
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度はまず神経組織所見：脊髄、傍脊髄神経節（DRG）の免疫組織学的評価。膝関節内および膝関節周囲で生じる疼痛は末梢神経からDRGを経由し上行し、脊髄後角へと入る。脊髄後角から対側の白質を上行し、脳へ達する。逆行性トレーサーであるFluoro Goldを関節内に注射し、注射後1週間で還流固定を行い、脊髄、DRGを摘出し、凍結標本にして、スライスし切片とする。これを蛍光顕微鏡下で観察すると疼痛に対応した髄節、DRGを特定できる。またFG陽性の脊髄、DRG標本をGFAP、CGRPで免疫染色を行い、陽性細胞の数により評価する。これらのDRGでの結果と膝関節のSubstance P, CGRPの陽性細胞数との関係を検討する。
つづいて以下の実感をおこなう。①膝OAモデルにおけるMSCｓ関節内投与の抗炎症作用。関節内変化の炎症を評価するため免疫染色を行い、、滑膜炎や関節内の単球、好中球等浸潤細胞の局在、遺伝子発現を評価、解析し、MSCs投与の時期とその有効性について統計学的解析を行う。滑膜炎の所見を評価し、time point毎の違いを評価・検討する。滑膜に対しqPCRでサイトカインの発現を観察する。
②投与したMSCsの関節内の動態や分化の解明GFPラット由来のMSCsを使用する事により投与MSCsの動態を明らかにする。組織免疫染色や滑膜のqPCRを行い、投与したMSCsの局在や分化を観察し、検討する。
③モデルのよるMSCsの作用の違いラット関節炎モデルやラット変形性関節モデルはそれぞれに特性があるため、ヒト膝OAにおけるそれぞれの病態への効果を確かめるため、モデルを使い分けて、検討する。また免疫不全ラットを用いて、ヒト由来間葉系幹細胞で同様の検討をすることで、膝OAの疼痛改善や保存的治療対する間葉系幹細胞の有効な利用方法の可能性を探る。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度免疫染色を用いた以下の研究を立案していた。C)神経組織所見：脊髄、傍脊髄神経節（dorsal root ganglion :DRG）の免疫組織学的評価。膝関節内および膝関節周囲で生じる疼痛は末梢神経からDRGを経由し上行し、脊髄後角へと入る。脊髄後角から対側の白質を上行し、脳へ達する（Zhang RX. et al. OAC 2013）。逆行性トレーサーであるFluoro Goldを関節内に注射し、注射後1週間で還流固定を行い、脊髄、DRGを摘出し、凍結標本にして、スライスし切片とする。これを蛍光顕微鏡下で観察すると疼痛に対応した髄節、DRGを特定できる。またFG陽性の脊髄、DRG標本をGFAP、CGRPで免疫染色を行い、陽性細胞の数により評価する。これらのDRGでの結果と膝関節のSubstance P, CGRPの陽性細胞数との関係を検討する。
しかし、免疫染色の手法の確立が行えず、ラットの飼育を要さなかったため、費用が少なかった。来年度上記試験を行うため、来年度に繰り越して資金を使用するよていである。
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