|
本研究ではsiRNA libraryをベースとした網羅的スクリーニングにより同定されたDNA損傷修復因子RAD51のDNA損傷部位の集積IRIF形成能に関わる新規候補因子の中からmRNAプロセシングに関連するメディエーター複合体の構成因子を抽出してDNA損傷修復経路への具体的なメカニズムを検討した。相同組換え修復経路への寄与を検討するため、siRNAによるノックダウン下での既知のDNA損傷修復因子の損傷部位への集積を蛍光免疫染色で評価し、同経路において寄与する段階を同定した。相同組換え修復能をDR－GFP U2OS細胞を用いて検討した。
候補因子とBRCA1のBRCT領域の結合能をGST pull down法にて評価し、DNA損傷修復経路への直接的寄与を示すためにLaser microirradiation法を用いて検討した。
本研究では、新規候補因子が含まれるmRNAプロセシング因子の異常が癌や神経変性疾患の原因であることに着目し、これらの経路の異常とDNA損傷との関連を検討した。その機序の一つとしてプロセシングが適切に行われなかったmRNAが鋳型のDNAと結合して生じるR-loopというDNA-RNA hybridに注目し、新規候補因子のノックダウン下での細胞内のR-loop蓄積をS9.6抗体による免疫染色にて評価した。この経路がBRCA1の異常による卵巣癌発癌の原因である可能性が強く示唆されており、全エクソンシークエンスの解析で判明したmRNAのプロセシングに変異を認める卵巣癌臨床検体においてR-loopの蓄積をS9.6抗体による免疫染色にて評価した。
|
