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ラット顆粒膜細胞の黄体化過程において、Vegf遺伝子発現は増加することが示されている。その転写因子を探るため、JASPAR databaseを用いてVegf遺伝子プロ
モーター領域の転写因子結合配列を検討し、HIF1a、C/EBPbの結合配列を確認した。そこでHIF1a、C/EBPbタンパク発現変化をウエスタンブロットを用いて検討した。ラット顆粒膜細胞においてはHIF1a、C/EBPbともに発現しており、さらに黄体化過程においてタンパク発現は増加することが明らかとなった。そこでVegf遺伝子プロモーター領域への転写因子HIF1a、C/EBPbの結合をChIP assayを用いて評価した。HIF1aについては転写因子への結合変化を認めなかったが、C/EBPbは黄体化過程で増加していることがわかった。そこでVegf遺伝子プロモーター領域に存在するC/EBPb結合配列の転写活性をLuciferase assayを用いて評価した。ラットVegf遺伝子プロモーター領域を組み込んだLuciferase コンストラクトを作成しヒト顆粒膜細胞種細胞株であるKGN細胞に導入してLuciferase assayを行った。この結果C/EBPb結合配列は転写活性を有していることが判明した。さらに、C/EBPbのノックダウンを行ったところ、Vegf遺伝子発現は抑制され、Luciferase活性も抑制されることが判明した。
このC/EBPb結合領域のヒストン修飾をChIP assayを用いて、クロマチン構造変化をFAIRE-qPCRを用いて評価し、やはり転写調節に関わる部位であることが判明した。
Vegf遺伝子プロモーター領域のメチル化をBisulfite sequence法を用いて評価したが、黄体化過程で変化は認めなかった。
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