| 研究課題/領域番号 |
18K16821
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| 研究機関 | 川崎医科大学 |
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研究代表者 |
石田 剛 川崎医科大学, 医学部, 講師 (90509225)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 早産 / 炎症 / 神経発達 |
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| 研究実績の概要 |
早産の多くが子宮内の局所的な炎症が原因と言われている。また、早産児の神経障害の予後は感染症が重要な要因であるが、神経障害が未熟性によるものなのか、感染症によるものなのかは現時点では知られていない。大脳皮質において胎生期から生後にかけて神経前駆細胞 ( Neural progenitor cell, NPC ) は時期に応じて神経細胞、続いてグリア細胞へ分化し、最終的な脳の構造が完成する。NPC から分化する細胞運命の決定に着目し、子宮内感染のモデルマウスを用いて検証する予定である。今回の研究では、早産・子宮内感染モデルマウスは既知のLPS(Lipopolysaccharides)投与モデルを導入することによって、流産に至らないLPS投与量上限を投与したマウスにおいて、大脳皮質における神経細胞の細胞運命の変化を正常群と比較し、出生後の行動等に及ぼす影響に関して解析する。胎生16日目（E16）の妊娠マウスを腹腔内麻酔下に、開腹して妊娠子宮を確認後、胎児間の卵膜外に必要量のLPSを投与した。2019年度までに早産モデルマウスを作成する予定であったが、LPS投与による胎児脳での炎症の変化を観察している段階である。流産に至らないLPSの投与量の境界を同定し、それよりも高濃度の場合と含めて、投与後の胎児、及び新生児マウスの脳組織における炎症反応の増減をリアルタイムPCRにより確認している。流産に至らないLPS投与量上限を投与したマウスの脳組織において、投与した翌日までは炎症反応の増加が期待された。しかし出生まで待機した胎児の脳組織においては炎症反応の発現に差は認めなかった。現在この結果が実験方法によるものなのかを含めて検討中であるが、まだ判断に苦慮している。同時にLPS投与後の胎児及び新生児マウスの脳組織の分化の違いがないかについて、観察方法を模索している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
今回の実験では、これまでの報告とはよりも100倍以上希釈したLPSを投与しなければ生存児は得られなかった。その原因としてLPSの投与方法や手技的な問題、LPS製剤の純度の違いがあると考え、検証を続けている。異なる濃度検討で低濃度群、中間群、高濃度群に分けて検証していた。それぞれのLPS投与濃度において、LPSを投与した翌日の胎児マウスと、出生直後の新生児マウスの脳組織中の炎症反応の発現をリアルタイムPCRを用いて測定した。炎症マーカーとしてはcox2、TNFα、IL-1β、IL-6の発現を検証した。その結果、境界群においてはE16で取り出した脳での炎症反応は上がっていた。それに
対し、出生直後では炎症反応の増加は認めなかった。炎症マーカーの中で特にIL-6が最も顕著に発現の増加を認めた。この結果からLPSを投与した次の日は炎症反応が高いが、出生後はむしろ低下していた。
これまでの結果からE15でLPSを投与し、E16で取り出した脳の炎症反応が高いのは自然免疫によって直ちに炎症性物質が代謝された結果であると考えられる。そしてE15でLPSを投与し、P1～2で取り出した脳の炎症反応がむしろ下がっていた理由は免疫反応が働き炎症が治まった後であると考えている。現在サンプル数を増やし、実験行程も見直している段階である。
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| 今後の研究の推進方策 |
少なくともLPSを投与した直後に炎症反応の上昇は確認されたものの、実際の早産症例の様に、慢性化した炎症反応上昇のモデルの確立が必要であると考えている。その為にLPSのデポー製剤の作成や、投与方法の変更を検討したが、作成方法を変えることで更にマウスに対する影響が考えられ、実現に至っていない。作成が実現できそうであれば、マウスに投与して影響を評価していきたい。
流産に至る下限の量が判定し、現時点では一時的な炎症反応上昇のモデルマウスとなるが、それでも神経発生への影響がどうかを検討中である。最終的には早産に至る前の脳組織と、慢性炎症が神経発育にどの様に影響するかを調べ、早産による神経発達に障害を及ぼす原因が早産における感染・ 炎症なのか、未熟性であるかについて解析していく事が目標である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年の実験においては、LPSの子宮内投与によりマウスの新生児脳に炎症反応を評価することが中心となり、昨年までに行う予定であったLPS投与後の胎児及び新生児マウスの脳組織の神経発達の比較評価は遅延している。それにより組織マウスの新生児脳における分化の違いをPCR,免疫組織学検査などを用いて実験する費用を来年度に持ち越す為、次年度使用額が生じた。
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