2021 年度実施状況報告書

早産、炎症における大脳皮質の発生に対する影響についての解析

研究課題

研究課題/領域番号	18K16821
研究機関	川崎医科大学
研究代表者	石田剛川崎医科大学, 医学部, 講師 (90509225)
研究期間 (年度)	2018-04-01 – 2023-03-31
キーワード	早産 / 炎症 / 神経発達
研究実績の概要	早産の多くが子宮内の局所的な炎症が原因と言われている。また、早産児の神経障害の予後は感染症が重要な要因であるが、神経障害が未熟性によるものなのか、感染症によるものなのかは現時点では知られていない。大脳皮質において胎生期から生後にかけて神経前駆細胞 ( Neural progenitor cell, NPC ) は時期に応じて神経細胞、続いてグリア細胞へ分化し、最終的な脳の構造が完成する。NPC から分化する細胞運命の決定に着目し、子宮内感染のモデルマウスを用いて検証する予定である。今回の研究では、早産・子宮内感染モデルマウスは既知のLPS(Lipopolysaccharides)投与モデルを導入することによって、流産に至らない LPS投与量上限を投与したマウスにおいて、大脳皮質における神経細胞の細胞運命の変化を正常群と比較し、出生後の行動等に及ぼす影響に関して解析する。胎生16日目（E16）の妊娠マウスを腹腔内麻酔下に、開腹して妊娠子宮を確認後、胎児間の卵膜外に必要量のLPSを投与した。2019年度までに早産モデルマウスを作成する予定であったが、LPS投与による胎児脳での炎症の変化を観察している段階である。流産に至らないLPSの投与量の境界を同定し、それよりも高濃度の場合と含めて、投与後の胎児、及び新生児マウスの脳組織における炎症反応の増減をリアルタイムPCRにより確認している。流産に至らないLPS投与量上限を投与したマウスの脳組織において、投与した翌日までは炎症反応の増加が期待された。しかし出生まで待機した胎児の脳組織においては炎症反応の発現に差は認めなかった。現在この結果が実験方法によるものなのかを含めて検討中であるが、まだ判断に苦慮している。同時にLPS投与後の胎児及び新生児マウスの脳組織の分化の違いがないかについて、観察方法を模索している。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 4: 遅れている理由これまでの実験では、これまでの報告よりも100倍以上希釈したLPSを投与しなければ生存児は得られなかった。その原因としてLPSの投与方法や手技的な問題、LPS製剤の純度の違いがあると考え、検証を続けてきた。現時点では投与方法がある程度確立されており、結果としてはLPS製剤の純度の違いであると考えている。異なるLPS濃度検討で低濃度群、中間群、高濃度群に分けて検証し、投与後1日目の胎児マウスと、出生直後の新生児マウスの脳組織中の炎症反応の発現をリアルタイムPCRを用いて測定した。炎症マーカーとしては cox2、TNFα、IL-1β、IL-6の発現を検証した。その結果、境界群においてはE16で取り出した脳での炎症反応は上がっていた一方で、出生直後では炎症反応の増加は認めなかった。炎症マーカーの中で特にIL-6が最も顕著に発現の増加を認めた。この結果からLPSを投与した次の日は炎症反応が高いが、出生後はむしろ低下していた。これまでの結果からE15でLPSを投与し、E16で取り出した脳の炎症反応が高いのは自然免疫によって直ちに炎症性物質が代謝された結果であると考えられる。そしてE15でLPSを投与し、P1～2で取り出した脳の炎症反応がむしろ下がっていた理由は免疫反応が働き炎症が治まった後であると考えている。現在サンプル数を増やし、大脳皮質の切片を作製しLPS投与群と非投与群との間で組織学的な違いについての検討を計画している。
今後の研究の推進方策	予定では実際の早産症例の様に、慢性化した炎症反応上昇のモデルの確立をする必要があっった。その為にLPSのデポー製剤の作成や、投与方法の変更を検討したが、実現に至らなかった。現時点では流産に至る下限の量が判定し、一時的な炎症反応上昇のモデルマウスとなるが、それでも神経発生への影響がどうかを検討中である。昨今取りざたされているグリア細胞への分化についても解析を行っていくことで、最終的には早産に至る前の脳組織と、慢性炎症が神経発育にどの様に影響するかを調べ、早産による神経発達に障害を及ぼす原因が早産における感染・炎症なのか、未熟性であるかについて解析していく予定である。
次年度使用額が生じた理由	実験そのものが予定通り進行しておらず、遅れている為、今年までに使用する予定であった物品も予定通り購入できていない。次年度使用額はこれまでに行うことが出来なかった、免疫染色等の比較実験、解析の為に使用する予定である。