| 研究課題/領域番号 |
18K16840
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
石川 正昭 京都大学, 医学研究科, 客員研究員 (10813743)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 嗅上皮 / 組織培養 / OMP-GFPマウス / 嗅球 / 共培養 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は嗅上皮の特色である3層構造を保持した組織培養法を確立し、嗅上皮の再生機序を解析できるin vitroモデル系の確立を目指す計画である。本年度は下記3点につき検討を行った。
①嗅上皮の3層構造を構成する各細胞の評価方法：ICRマウス、および、OMP-GFPマウスの鼻中隔組織を用いて、嗅上皮の3層構造をHE染色および免疫染色で評価する方法を検討した。免疫染色では、支持細胞と基底細胞に特異的なマーカーとしてSox2、基底細胞に特異的なマーカーとしてp63、成熟した嗅神経細胞に特異的なマーカーとしてOMP、未熟な嗅神経細胞を含む神経系細胞に特異的なマーカーとしてTubIIIの抗体を用いて、マウス嗅上皮組織の各細胞の評価方法を確立した。
②ICRマウスを用いた嗅上皮組織培養での短期間培養モデルの検討：ICRマウスの鼻中隔組織を用いて、マウス嗅上皮組織培養の短期間培養（48時間）モデルを検討した。検討項目として、培地、培養組織の固定方法および脱灰方法、培養組織での3層構造を確認するためのHE染色方法および免疫染色方法の至適条件を検討した。
③トランスジェニックマウス（OMP-GFPマウス：B6;129P2-Omptm3Mom/MomJ）の導入：本研究での嗅上皮組織培養モデル、及び、嗅上皮―嗅球シナプス形成モデルにおいて、嗅神経細胞の脱落や再生、軸索伸長やシナプス形成を詳細かつ継時的に観察する目的に、嗅神経に特異的なタンパク質（Olfactory marker protein: OMP）をコードする遺伝子をGFPで置換したOMP-GFPマウスをThe Jackson Laboratoryより購入し導入した。ヘテロでの導入であったため、当施設内で交配を行い、Genotypingでホモ個体を確認し、ホモ個体での継代に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
培養条件の検討と評価法の確立を行い、嗅上皮培養法はおおむね確立できた。また、大量の条件検討を容易にするためのOMP-GFPマウスの導入も完了し、次年度からの障害、再生モデルや共培養系の確立への準備を終えることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
嗅上皮組織培養法とその評価法が確立できたので今後は下記解析を行う。
①嗅上皮障害モデルの確立：まず薬剤障害モデル作製の条件検討を行う。Iで確立した培養条件に、動物実験で用いられているメチマゾール、5-FUなどの薬剤を添加。濃度、処理期間等を検討し基底層のみ生存する条件を検討し障害モデルを確立する。物理的損傷等についても検討を行う。
②嗅上皮再生モデルの確立：①で確立した障害モデルを継続して培養し（薬剤障害モデルは薬剤を除去して培養継続）、再生可能か検討する。再生しなければ、培養条件を再検討する。
③嗅上皮―嗅球シナプス形成モデルの確立：嗅球組織を嗅上皮再生モデルと共培養し、再生嗅神経から嗅球組織への軸索伸長、シナプス形成について検討する。必要に応じ増殖因子の添加など培養条件を検討する。嗅上皮、嗅球組織を異なる色の神経軸索トレーシング用蛍光色素で標識し、経時的に観察する。伸長軸索が嗅球に至れば組織を固定しシナプスマーカーの染色によりシナプス形成の有無を検討する。シナプス形成が確認されることをゴールとする。
④組織培養モデルを用いた嗅上皮再生機序の解明及び薬剤効果の検証：本研究で確立したモデルを用い、嗅上皮再生機序の解析と薬剤効果の検討を行う。まず動物実験や培養細胞からの知見について検証し、次に嗅上皮では報告がない薬剤や増殖因子などの治療効果について検討する。嗅上皮再生モデルでは再生時間の短縮、嗅上皮-嗅球シナプス形成モデルでは軸索伸長の速さやシナプス形成の頻度等を治療効果の指標とする。治療効果のあるものが同定されれば、動物実験による検討を行い、関連遺伝子についてRT-PCR, 免疫染色法、遺伝子の強制発現やsiRNAの導入, 阻害剤やアゴニストなどを用いた情報伝達系の調節による検討を行い嗅上皮再生機序の解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
トランスジェニックマウスの導入の費用、および、現在投稿を控えている論文の投稿費が年度を越えて発生する可能性があったため、次年度使用額が生じた。
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