| 研究課題/領域番号 |
18K16946
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
木村 麗子 (山岸麗子) 東京大学, 医学部附属病院, 特任研究員 (80704642)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ヒト線維柱帯細胞 / メカノセンサー / TRPV4 |
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| 研究実績の概要 |
初代ヒト線維柱帯細胞（HTM)を用いて、TRPVファミリーとPIEZOファミリーのmRNA発現量をreal -time PCR法にて比較した結果、PIEZO1およびTRPV4の発現が確認された。また、PIEZO1およびTRPV4についてHTM細胞へそれぞれ20nM siRNA処理をした結果、PIEZO1およびTRPV4共に、siRNA処理で30-40%程度までmRNAレベルが有意に低下し、HTM細胞においてPIEZO1およびTRPV4遺伝子をKnock down（KD)させることに成功した。
続いて、siRNA処理後のHTMに対し、TRPV4およびPiezo1 agonistによる[Ca2+]i上昇について検討した結果、細胞内[Ca2+]上昇は、それぞれの遺伝子に対するsiRNA処理によって有意に減少しており、機能的にもそれらの作用をKDさせることに成功した。
ここで得られたKD処理済みのHTMを用いて、伸展刺激に対する作用について引き続き検討した結果、30%伸展刺激をKD済みのHTMに与えると、TRPV4およびPiezo1 siRNA処理をした場合には[Ca2+]i上昇が抑制されている傾向であったことから、伸展刺激による[Ca2+]流入にはPiezo1およびTRPV4をそれぞれ介していることが明らかになった。さらに、脂質メディエーターの一斉定量解析結果より、伸展刺激によりアラキドン酸、PGE2が有意に増加し、その増加はPiezo1またはTRPV4 siRNA処理した細胞では認められなかった。また、伸展刺激と同様にPiezo1アゴニストYoda1およびTRPV4アゴニストGSK1016790aでもアラキドン酸、PGE2が有意に増加した。以上より、伸展刺激によるアラキドン酸、PGE2の産生にPiezo1およびTRPV4が関わっていることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
輸入ヒト角膜組織からHTM細胞を単離培養するのに、かなりの時間と経費がかかることが進捗に影響を与えている。また、伸展刺激を一定に細胞へ負荷する技術も、比較的難しいことも影響を与えている。しかしながら、HTM細胞の単離も伸展刺激負荷も、繰り返し行うことで技術を習得しつつあるため、少しずつ検討スピードは向上していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞実験である程度結果ができているため、動物実験を行うことを考えている。内容としては、TRPV4 KOマウスおよび野生型マウスに対して、人工的に前房内圧を変動させることで、TRPV4の発現に変化が見られるか、とういことをRNA scopeを用いた実験で検討予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
動物実験を行う予定であったが、研究室の引っ越しで一時動物実験施設が停止していたため、動物実験を実施できなかった。そのため、次年度以降にその経費を繰越して使用することとした。
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