| 研究課題/領域番号 |
18K16965
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
山口 昌大 順天堂大学, 医学部, 准教授 (20574700)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 角膜内皮細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、角膜内皮細胞培養シートを用いて、多光子励起顕微鏡(MPLSM)による角膜内皮細胞のNADH/NADPH自家蛍光の測定、新しい角膜内皮細胞機能の評価機器の構築を目指すことである。NADHをマーカーとした細胞活性を評価することができれば、一般臨床では角膜移植の効率的な術式選択が可能となる。基礎研究においても、 ES細胞、iPS細胞を用いた角膜内皮再生医療の発展が期待される。培養を行っても、実際の移植において細胞機能を評価することは重要である。現在はNa/K ATPase、ZO-1、N-Cadherinなどの機能マーカーを用いることでin vitroの機能評価はできるが、移植前後のin vivoにおける評価はスぺキュラマイクロスコープによる細胞密度のみである。MPLSMによる生体イメージングが可能になれば、再生医療分野での臨床応用の成功に大きく寄与できると考える。昨年度は異なる細胞密度(500、1000、2000、3000個/mm2)の培養シートにおいて、ある条件下でNADH/NADPHの自家蛍光を撮影し、発光強度に差が生じた。本年度は内皮細胞のポンプ機能を抑制するouabainを用いて、ポンプ機能の差異による信号強度の違いを測定することが目標であった。しかし、ouabain濃度の条件設定がうまくいかず、MPLSMの発現強度を比較することができなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
当初の計画では本年度にポンプ機能抑制の条件下でのNADH/NADPHの発現比較をおこなう予定であったが、条件設定に時間が要した。また、COVID-19によって実験施設の使用制限が生じ、大幅な遅れを生じるため、本年内に終了することがで きなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の目標は、in vivo水疱性角膜症家兎モデルへのシート移植、NADH/NADPH自家蛍光測定である。異なる細胞密度(500、1000、2000、3000/mm2)の培養内皮細 胞シートを移植し、MPLSMを用いた撮影でNADH/NADPHの自家蛍光から内皮機能を測定する。術後(術翌日、3日、1 週間、2週間、1月)の角膜厚、ZO-1、Na/K ATP- ase, Phalloidinの免疫染色、タンパク発現を測定し、NADH/NADPHの自家蛍光との相関を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度はouabainポンプ機能抑制の条件下でのNAD/NADP の発現比較をおこない、in vivo動物実験に移行する予定であったがoubain条件設定がうまくいかず、実験が終了できなかったため、海外の学会で発表することができなかった。来年度は動物実験を予定しており、本年度分を繰り越して使用する予定である。
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