| 研究課題/領域番号 |
18K17005
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| 研究機関 | 日本医科大学 |
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研究代表者 |
青木 雅代 日本医科大学, 医学部, 講師 (40465282)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | lncRNA / ケロイド / 細胞外マトリックス / 線維芽細胞 / マトリックス分解酵素 |
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| 研究実績の概要 |
ヒト正常皮膚およびケロイドから、初代線維芽細胞（KF）を培養した。マイクロアレイ法を用いて、遺伝子発現解析とlncRNA解析を網羅的に行った (n=2)。細胞外マトリックス分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ (MMP)-1, 3, 7, 10が発現低下を示しており、線維化の進行に関与すると考えられた。これらのMMPsはすべて、遺伝子マップ上、染色体11q22.2に位置している。そこで、染色体11q22.2付近に位置するlncRNAに絞りこんで解析を行った。正常皮膚線維芽細胞と比較して、ケロイドで発現変動の大きいlncRNAを抽出したところ、H19とLINC00900がそれぞれ23倍、7倍の発現上昇を示した。
次に、サンプル数を追加し、定量的RT-PCRによるマイクロアレイ結果の検証を行った（n=9）。MMPについては、MMP-1および3で、有意な発現低下が確認された。H19は有意差は認めなかったが、LINC00900において有意な発現上昇が確認された。
次に、遺伝子導入実験により、LINC00900の役割を調べることとした。LINC00900全長をPCRにて増幅し、プラスミドベクターpcDNA3.1に組み込んだ。まず、購入したヒト真皮由来正常線維芽細胞（NHDF）に遺伝子導入した。しかし、LINC00900の過剰発現によるMMPの発現制御は確認できなかった。
今後、KFを培養し、LINC00900発現プラスミドの遺伝子導入を行っていく。MMPの発現制御が認められれば、転写因子AP-1の制御および親和性のあるmiRNAの媒介の可能性について検討していく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
今年度の進捗が遅れた原因は、プラスミド構築に予想以上に時間を要したことである。lncRNA全長をプラスミドに組み込む手技は、周囲に経験者もなく比較的困難であったが、最終的に目的のプラスミドの構築に成功することができている。新たな核酸治療ターゲットの特定をめざし、引き続き実験を進めていく。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、KFを培養し、LINC00900発現プラスミドの遺伝子導入を行ってみる予定である。MMPの発現制御が認められれば、転写因子AP-1の制御および親和性のあるmiRNAの媒介の可能性について検討していく。一方、予想された効果が得られなかった場合、LINC00900に親和性のあるmiRNAの中で、過去に機能の報告のあるものに絞り検討していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
プラスミド構築が比較的困難であり、予想以上に時間を要したため、今年度の進捗が遅れた。しかし、最終的に目的のプラスミドの構築に成功することができた。
今後、KFを培養し、LINC00900発現プラスミドの遺伝子導入を行ってみる予定である。MMPの発現制御が認められれば、転写因子AP-1の制御および親和性のあるmiRNAの媒介の可能性について検討していく。一方、予想された効果が得られなかった場合、LINC00900に親和性のあるmiRNAの中で、過去に機能の報告のあるものに絞り検討していく予定である。新たな核酸治療ターゲットの特定をめざし、次年度に引き続き実験を進めていく。
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