|
平成30年度は、オートファジーが、ヒト歯根膜細胞の酸化ストレス応答においていかなる役割を果たすかを、in vitro細胞イメージングならびに定量的解析を用いて解明した。
ヒト歯根膜細胞のオートファジー活性の変化が細胞内ROS量に与える影響を検討し、さらに、オートファジー阻害下でのミトコンドリアの形態変化を、共焦点顕微鏡を用いて解析した。さらに、透過型電子顕微鏡を用いることで微細な形態変化の詳細な検討を行った結果、オートファジー阻害下では、異常な形態のミトコンドリアが増加することが明らかとなった。また、オートファジー阻害下ではミトコンドリア由来ROSが増加することが明らかとなった。
平成31年度は、平成30年度の研究課題を継続するとともに、2種類の蛍光プローブGFP-LC3-RFP-LC3ΔGとGFP-LC3-RFP-LC3ΔGを用いて、歯根膜細胞のオートファジー活性の定量化と、従来困難であった基底レベルのオートファジーの解析を行った。これにより、様々な化学刺激や炎症性サイトカインなどの歯周病病態を模した侵害刺激が歯根膜オートファジーに及ぼす影響が明らかとなった。さらに、ダメージミトコンドリアのマイトファジーによる分解、排除の生体ダイナミクスを詳細に検討するため、pHにより蛍光特性が変化し、リソソーム内でも分解されない蛍光タンパクKeimaに、ミトコンドリア局在配列を連結したmt-Keimaをヒト歯根膜細胞に導入し、 安定発現株を樹立した。また、パーキンソン病の原因遺伝子の一つであり、ダメージミトコンドリアの膜に結合するPARKIN遺伝子を導入し、歯根膜マイトファジーに及ぼす影響を解析した。
|
