| 研究課題/領域番号 |
18K17215
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
武田 裕利 東北大学, 大学病院, 助教 (60806339)
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| 研究期間 (年度) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 金属アレルギー / パラジウム（Pd） / T細胞受容体（TCR） / Pd特異的TCR遺伝子導入細胞 / Pd特異的TCR遺伝子導入マウス |
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| 研究実績の概要 |
申請者はパラジウム（Pd）に反応する病原性T細胞に着目し、金属アレルギーにおける抗原提示の分子機構を明らかにすることを目的とし、本研究を遂行するために、申請者が特定したPdアレルギー特異的なTCRαを用いて遺伝子導入細胞株および遺伝子導入マウスを作製することとした。
Pd特異的TCR遺伝子導入細胞株の樹立に対し、申請者が設定した実験計画においてPd特異的TCR鎖の塩基配列をPCRで増幅し、GFPなどを組込んだベクターにPCR産物をライゲーションし、正確にライゲーションできていることを確認した。次にPd特異的TCR遺伝子導入マウスの作製については実験計画に対し、クローニングベクターからPd特異的TCRの塩基配列を取り出し、発現ベクターにPd特異的TCRの塩基配列をライゲーションした。発現ベクターには正確にライゲーションできていることを確認した。また学会活動においてはThe 57th Congress of Korean Association of Maxillofacial Plastic and Reconstruction Surgeonsや第63回公益社団法人日本口腔外科学会総会・学術大会において発表を行い、日本口腔外科学会総会・学術大会では「金属アレルギー発症における病原性T細胞の同定」をテーマに優秀口演発表賞を受賞した。
次年度の予定は、設定した実験計画に則りPd特異的TCR遺伝子導入細胞株の樹立に関してはTCRα－β－細胞株にウイルスベクターを用いて遺伝子導入し、Pd特異的TCR遺伝子導入細胞をセルソーターで回収し、蛍光顕微鏡で確認することを目標としている。Pd特異的TCR遺伝子導入マウスの作製についてはPd特異的TCR遺伝子導入マウスの飼育・維持を行い、実験に使用できる世代まで飼育を続ける。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請者はすでにPdアレルギー特異的なTCRα鎖の特定を行っており、TCRのレパートリーこのTCRレパートリーを用いて遺伝子導入する実験から開始した。Pd特異的TCR遺伝子導入細胞株の樹立に対し、申請者が設定した６ステップの実験計画のうち、1. Pd特異的TCR鎖の塩基配列をPCRで増幅する、2. GFPなどを組込んだベクターにPCR産物をライゲーションする、3. ライゲーション後のPd特異的TCRの塩基配列をシークエンサーで確認する。まで進んだ。ベクターを切断・ライゲーションする作業が数回あり、煩雑であったため、最終的な遺伝子導入に使用するベクターを構築するので期間を要したが、3. 正確にライゲーションできていることを確認した。次にPd特異的TCR遺伝子導入マウスの作製については５ステップの実験計画のうち、1. クローニングベクターからPd特異的TCRの塩基配列を取り出す、2. 発現ベクターにPd特異的TCRの塩基配列をライゲーションすることまで進んだ。発現ベクターに組み込む際も数回の切断・ライゲーションと発現ベクターには正確にライゲーションできていることを確認した。今後は実験計画に沿って研究を進めていく。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究の推進としては、設定した実験計画に従って、研究を進めていく。具体的にはPd特異的TCR遺伝子導入細胞株の樹立に関しては６ステップの実験計画のうち、4. TCRα－β－細胞株にウイルスベクターを用いて遺伝子導入する、5. Pd特異的TCR遺伝子導入細胞をセルソーターで回収し、蛍光顕微鏡で確認する、6. この遺伝子導入細胞とPd処理した抗原提示細胞を共培養し、サイトカイン産生やT細胞の活性化、より詳細な抗原提示状況などをin vitroで解析することに対して研究を進めていく。Pd特異的TCR遺伝子導入マウスの作製に関しては3. Pd特異的TCRをインサートした発現ベクターをマウスの受精卵にインジェクションし、Pd特異的TCR遺伝子導入マウスを作製する、4. Pd特異的TCR遺伝子導入マウスの飼育・維持を行い、研究に使用できる世代まで飼育を行い、5. この遺伝子導入マウスを用いてPdアレルギーにおけるサイトカイン産生やT細胞の活性化の解析を行い、in vivoでより詳細な抗原提示状況を明らかにする手順で研究を進めていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた理由としては、実験計画の進行状況により、次年度使用額の物品費を次年度に購入する予定に変更になったため。
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