|
本研究は以下の 4研究項目のもとに、EMTが誘導する 4D 型高浸潤口腔癌細胞や癌関連線維芽細胞の形成過程で発現低下する MMPを調べた。さらに、PD-L1 を分解する MMP を特定し、既存の抗がん剤のなかからこのMMP発現を上昇させるものを同定した。
１、EMTが誘導する4D型高浸潤口腔癌や癌関連線維芽細胞の形成過程で発現低下するMMPの特定：申請者のこれまでの報告でOSC-20細胞が低浸潤性で上皮系細胞の性質をもつことが明らかになっている。この細胞培養液にTGF-βを添加し、EMTにより4D型高浸潤口腔癌細胞へ誘導した。同様に、ヒト正常歯肉線維芽細胞(HGF細胞)を EMTの誘導により、癌関連線維芽細胞へ移行させた。現在までMMPはヒトで23種類同定されており、これらの培養細胞でのMMP発現を解析し、EMTの誘導で発現低下するMMPを調べた。
２、EMTの誘導により4D型高浸潤口腔癌や癌関連線維芽細胞で発現低下するMMPのPD-L1分解活性の検討：HEK293細胞に、１の実験で特定されたMMPとPD-L1のタンパク発現ベクターを共導入し、それぞれのタンパクを恒常的に発現する安定発現細胞株を作製した。つぎに、MMPとPD-L1を安定発現するHEK293細胞の培養上清中に含まれる、細胞膜から切断されて遊離したPD-L1を、Western blot法にて調べた。PD-L1の遊離が亢進しているMMP安定発現株を調べ、PD-L1切断活性をもつMMPを特定した。
３、PD-L1のMMPによる切断活性の検討：膜結合部位を欠失し、C末端に6xHisタグを付加した分泌型PD-L1の発現ベクターを作製した。HEK293細胞から分泌されたPD-L1はHisタグカラムで精製した。精製したPD-L1をリコンビナントMMPとインキュベートし、切断断片をSDS-PAGEで解析し、PD-L1に分解活性をもつMMPを同定する。
４、PD-L1の分解活性を持つMMPを発現上昇させる抗がん剤の検討した。
|
