研究課題
C57BL/6Nマウスを用いた体外受精により受精卵を採取し、0.1 - 1.0 Gyのガンマ線を照射した後、胚盤胞期胚までの発生を経時的に観察した。0.5 Gyのガンマ線では、媒精後4時間から7時間で胚盤胞への発生率の低下を認め、特に媒精後5時間がピークであった。そこで媒精後５時間の受精卵に0.1 Gyと1 Gyのガンマ線を照射したところ、1 Gy照射の場合には約半数が１-４細胞期で停止し、発生が続いている残り半分も大半が桑実胚から胚盤胞期胚の段階で発生が停止した。これに対し、0.1 Gy照射では１-４細胞期での停止はごく少数であったが、約半数が桑実胚から胚盤胞期胚の間で発生が停止した。媒精後5時間の時点でのガンマ線照射が、約3日後の桑実胚から胚盤胞期胚の段階で発生を停止させる分子メカニズムを解明するために、次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析を試みた。まず、受精卵は潤沢な細胞の確保が難しいため少数の細胞からの次世代シーケンサー用ライブラリ作成を行う方法の確立を行った。SMART-Seq v4試薬を用いることでライブラリが作成出来ることを確認し、その過程で用いるバッファー等の条件検討も行った。現在0.1 Gyと1 Gyのガンマ線を照射した受精卵のうち、媒精後72時間で桑実胚まで発生している受精卵各10個を採取し、10個を一群としてライブラリを作成後、mRNA-Seqを行い、比較解析を行っている。
2: おおむね順調に進展している
これまでに受精卵に0.1 Gyと1 Gyという異なる線量の放射線を当てた際に起こる受精卵の反応を確認し、そのメカニズムを調べるための条件の選定行った。次に少数の桑実胚胚を単離し、次世代シーケンサー用のライブラリ作成をする検討を終えており、実際の条件でのシーケンスと比較解析を進めている。
現在進めている桑実胚段階での遺伝子発現解析から胚盤胞期胚への過程での受精卵の停止に関わる分子メカニズムについて検討する予定である。また、1 Gyでの初期の発生停止についても同様に遺伝子発現解析からの分子メカニズムの検討を行う。
条件等の検討が計画しているよりもスムーズに行い支出を抑えることが出来たため次年度使用額が発生している。今後のライブラリ作成試薬やシーケンス用試薬費用として使用する予定である。
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