| 研究課題/領域番号 |
18K19001
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
藤原 敬宏 京都大学, 高等研究院, 特定准教授 (80423060)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| キーワード | 超解像蛍光顕微鏡法 / アクチン膜骨格 / 1蛍光分子追跡 / バネ弾性 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、100 nm 程度の網目構造をもつアクチン細胞膜骨格の機械的特性 (バネ弾性) を、超高速１蛍光分子追跡によって定量する方法を確立し、網目構造自体を空間的に分解できる密度で超解像マッピングして形状的特性との相関を得ること、また、さらにそれを繰り返して動的特性まで得ることを目指す。すなわち、【１】アクチン膜骨格バネ弾性定量法の確立、【２】超解像弾性マッピング像の取得、【３】超解像弾性マッピング像による細胞運動の解析、の3つを目的とする。本年度は【１】を推進し、以下の進捗があった。
(1) 膜貫通型タンパク質がアクチン膜骨格に結合し、停留している期間に示す構造揺らぎを１蛍光分子運動追跡で正しく見積もるためには、観察単位時間（フレーム時間）に得られるフォトン放射数で決まる１分子位置決め精度が十分高い必要がある。数種類の蛍光色素を試した結果、100マイクロ秒フレーム時間 (時間分解能 10 kHz) の高速観察下、飽和放射速度 (励起光強度をそれ以上大きくしても放射フォトン数が増えない状態) で、放射フォトン数がもっとも多かった蛍光色素は Cy3 で、そのときの位置決め精度は約 20 nm であった。
(2) アクチン膜骨格に結合した細胞膜分子の運動のモンテカルロシミュレーションの結果から、バネ弾性を正確に見積もるためには、25マイクロ秒程度の時間分解能が必要であることが予想された。時間分解能 22マイクロ秒 (45 kHz) での観察の結果、Cy3 分子１個ではシグナルが不十分で、20 nm 位置決め精度のためには Cy3 分子を複数個（少なくとも5個）標識する必要があることがわかった。
(3) アクチン膜骨格に対するアフィニティーが高く、短時間のうちに何度も結合と解離を繰り返す膜貫通型プローブの開発を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2018年度は、100マイクロ秒時間分解能以上の高速観察下で、高い位置決め精度が得られる色素の選定を進めた。2019年度はこの結果をもとに、飽和放射速度での放射フォトン数がさらに多い色素の検索と、観察条件（暗状態を短くして飽和放射速度を上げる酸素濃度、還元剤／酸化剤の配合）の最適化をおこなう。また、2019年度以降に推進する、アクチン膜骨格の網目の超解像弾性マッピング像取得のための準備として、アクチン膜骨格への結合のオンレートが高く、短時間に何度も結合と解離を繰り返す膜貫通型プローブの開発に取りかかった。現在までに得られたプローブ (細胞質側にアクチン結合配列 Lifeact、細胞外に蛍光標識用の ACP タグを持つ) は、ACP の蛍光標識効率が低く、蛍光標識後に細胞内に取り込まれやすいという問題があるので、インド National Centre for Biological Science の共同研究者とともに、スペーサー配列の追加やタグの変更により、これらの問題の解決を目指している。
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| 今後の研究の推進方策 |
2019年度は、目的【２】超解像弾性マッピング像の取得を推進する。選定した色素と最適化した１蛍光分子観察条件下で、膜貫通型タンパク質プローブがアクチン膜骨格に結合して停留中の軌跡から、１分子位置決め精度の寄与分を差し引き、アクチン膜骨格の構造揺らぎ（バネ弾性）を正確に見積もる。これを 100 nm 程度に仕切られたアクチン膜骨格の網目上の多数の停留イベントに対しておこない、定量したバネ弾性にしたがって色分けした点で再構成することで、膜骨格の網目の超解像弾性マッピング像の取得を目指す。これを実現するためには、網目の形態変化が小さいようになるべく短時間（目標は30秒以下）で、100 nm の網目の可視化に十分な多数の停留点を取得する必要がある。膜骨格への結合のオンレートが高く、短時間に何度も結合と解離を繰り返す膜貫通型プローブ（既に開発に取りかかった）を改善し、利用する。さらに、正確にバネ弾性を決めるための超高速観察が可能な色素で、１分子像の空間的な重複が起こらず、より多数の停留点を取得できるように、適度な頻度で信号の明滅を繰り返す条件 (励起強度、酸素濃度、還元剤／酸化剤の配合) を見つける。超解像弾性マッピング像が取得できるようになった場合は、2020年度に予定している目的【３】を視野に入れ、接着斑構成分子 (パキシリン、ビンキュリン、タリンなど) の超解像観察との２色同時観察を実現するための細胞株を準備する。
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