| 研究課題/領域番号 |
18K19161
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
黒河 博文 東北大学, 多元物質科学研究所, 講師 (80359546)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| キーワード | タンパク質 / X線結晶構造解析 / センサー |
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| 研究実績の概要 |
食品に含まれる天然有機物のなかには，ヒトの酸化ストレスセンサーを介して酸化ストレスを消去する酵素群の遺伝子発現を誘導するものがある．この酸化ストレスセンサーが感知する天然有機物の一群は，多様な炭素骨格を有しており，その分子認識は従来の鍵と鍵穴モデルでは説明できない全く新しい機構によると考えられる．つまり，酸化ストレスセンサーが多様な天然有機物を認識するためには，タンパク質分子自体も柔軟な「アンサンブル構造」をとることが必須と考えられるのである．本研究ではタンパク質の「アンサンブル構造」という新しい概念に「酸化ストレスセンサーと有機化合物との複合体形成による準安定状態のトラップ」という手法で挑むものである．
まず，ヒト酸化ストレスセンサーの組換え型タンパク質の試料調製を行った。酸化ストレスセンサーのアミノ末端側のセンサー領域について大腸菌の組換型タンパク質として大量発現を行うため，発現ベクターは大腸菌のコドンに最適化したものを全合成し，さらに精製を効率化するための標識配列を付加した。この発現ベクターと大腸菌を用いて組換型タンパク質を大量発現した後、アフィニティー精製およびゲルろ過精製などにより高純度の組換えタンパク質を得ることができた。続いて結晶化条件のスクリーニングを行い，複数の条件で結晶を得ることができた。これらの結晶を用いてＸ線回折実験を実施したところ, X線回折を確認することができた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
酸化ストレスセンサーのN末端側のセンサー領域について組換えタンパク質の発現・精製・結晶化スクリーニングを行い，得られた結晶についてX線回折を確認することができた．構造解析が可能な高分解能データは得られていないが，これについては解決が可能と考えている．
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| 今後の研究の推進方策 |
酸化ストレスセンサーのセンサードメインに相当する組換えタンパク質を大量発現・精製・結晶化を行ったが，構造解析が可能な単結晶が得られていないため，結晶化条件の最適化を行う。また，良質な結晶を得るために部位特異的変異導入についても実施する予定である．
また，酸化ストレスセンサーと結合すると考えられている天然有機化合物は多数知られているが、本研究ではこれらの中から食品に由来する天然有機化合物を選択し，酸化ストレスセンサーとの相互作用について解析を実施する予定である．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初は酸化ストレスセンサー組換えタンパク質を調製し，大量発現や精製に問題が生じた場合は，分子サイズの異なる組換えタンパク質を調製する予定であった．しかし，最初に調製した組換えタンパク質試料で，結晶を得ることができたため，Ｘ線回折実験を先に実施することとなった。このため分子サイズの異なる試料調製に必要な経費の執行が当初の予定より遅れ，次年度使用額が生じたのである．
次年度使用額は，当初予定していた分子サイズの異なるタンパク質試料調製に用いて，翌年度分として請求した助成金は予定通り執行する予定である．
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