構造生物学的着想に基づく昆虫グルタチオンS-転移酵素Noboの内在性基質の同定

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19163
• 研究機関: 筑波大学
• 研究代表者: 丹羽 隆介 筑波大学, 生存ダイナミクス研究センター, 教授 (60507945)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2020-03-31
• キーワード: ステロイドホルモン / 昆虫 / 酵素 / 基質 / ハイスループットスクリーニング / X線結晶構造解析

研究実績の概要

本研究の実施当初は、Nobo結晶にハエ組織抽出物を漬け込み、その際にNoboの基質結合ポケットに入り込む化合物を直接同定することを試みた。しかし、昨年度の実験により、この方法論の実現は困難であると判断した。そこで今年度は、昨年度に引き続き、どのような化合物であれば基質結合ポケットに入り込めるのかをケミカルバイオロジーの手法で追究した。昨年度までに、ステロイドを含む複数の化合物が基質結合ポケットに入り込むことを見出した。
今年度は、得られたステロイド化合物の中から特に、哺乳動物の女性ホルモン17beta-エストラジオール（以下、エストラジオール）とショウジョウバエ由来Nobo（DmNobo）との複合体構造の解析を進めた。その結果、DmNoboの113番目のアスパラギン酸残基（D113）が、エストラジオールのA環の水酸基と水素結合を有することを見出した。この水素結合の重要性を検討するため、D113をアラニンへと置換した変異型DmNoboを用いた生化学試験を行った結果、エストラジオールの阻害活性は変異型タンパク質では消失した。
次に、D113がショウジョウバエの内在性機能にも重要かを検討するため、ショウジョウバエで整備されているCRISPR-Cas9法を用いた点変異導入技術を利用し、nobo 遺伝子の 113 番目残基をコードする塩基に変異を入れ、アスパラギン酸ではなくアラニンを持つ変異型 nobo アリルを得た。このアリルのホモ接合体は胚性致死であった。また、変異ホモ接合体の胚では表皮クチクラの分化が進まず、頭部陥入不全の形態形成異常が観察された。これらの表現型は、nobo 完全機能欠損アリルの表現型に酷似していた。この結果は、D113が生体内の DmNobo の機能にも必須であることを強く示唆し、また内在性基質もこの D113 と相互作用することを暗示する。

研究成果

• [雑誌論文] An integrated approach to unravel a crucial structural property required for the function of the insect steroidogenic Halloween protein Noppera-bo (2020)
  • 著者名/発表者名: Kotaro Koiwai, Kazue Inaba, Kana Morohashi, Sora Enya, Reina Arai, Hirotatsu Kojima, Takayoshi Okabe, Yuuta Fujikawa, Hideshi Inoue, Ryunosuke Yoshino, Takatsugu Hirokawa, Koichiro Kato, Kaori Fukuzawa, Yuko Shimada-Niwa, Akira Nakamura, Fumiaki Yumoto, Toshiya Senda, Ryusuke Niwa
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: － ページ: －
  • DOI: 10.1074/jbc.RA119.011463
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 植物トリテルペノイド cucurbitacin B によるエクダイソン生合成の阻害 (2020)
  • 著者名/発表者名: 小野 肇、豊福 美和子、藤永 大輝、稲葉 和恵、船橋 智輝、藤川 雄太、井上英史、片岡 宏誌、丹羽 隆介
  • 学会等名: 第64回日本応用動物昆虫学会大会
• [学会発表] ステロール代謝およびエクダイソン生合成を介した植物トリテルペノイドcucurbitacin 類がショウジョウバエの発育に及ぼす影響 (2020)
  • 著者名/発表者名: 小野 肇、豊福 美和子、藤永 大輝、稲葉 和恵、船橋 智輝、藤川 雄太、井上英史、片岡 宏誌、丹羽 隆介
  • 学会等名: 日本農薬学会第45回大会
• [学会発表] Automated X-ray crystallographical inhibitors screening against an insect embryogenesis regulator, Noppera-bo (2019)
  • 著者名/発表者名: 小祝 孝太郎、稲葉 和恵、湯本 史明、丹羽 隆介、山田 悠介、千田 俊哉
  • 学会等名: CBI学会2019年度大会
• [学会発表] Combined experimental and computational approaches reveal a unique structural property of the Halloween glutathione S-transferase Noppera-bo (2019)
  • 著者名/発表者名: Kotaro Koiwai, Kazue Inaba, Kana Morohashi, Sora Enya, Riyo Imamura, Takayoshi Okabe, Hirotatsu Kojima, Tetsuo Nagano, Kaoru Fukazawa, Ryunosuke Yoshino, Takatsugu Hirokawa, Hideshi Inoue, Youth Fujikawa, Fumiaki Yumoto, Toshiya Senda, Ryusuke Niwa
  • 学会等名: 4th International Insect Hormone Workshop
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 昆虫特異的グルタチオン S 転移酵素による発生・分化制御機構の解明 (2019)
  • 著者名/発表者名: 小祝 孝太郎、稲葉 和恵、諸橋 香奈、塩谷 天、荒井 怜奈、藤川 雄太、井上 英史、小島 宏建、岡部 隆義、長野 哲雄、湯本 史明、千田 俊哉、丹羽 隆介
  • 学会等名: 第19回日本蛋白質科学会年会 第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会
• [学会発表] 新規農薬開発に向けた昆虫グルタチオン S- 転移酵素 Noppera-bo の阻害剤探索 (2019)
  • 著者名/発表者名: 稲葉 和恵、小祝 孝太郎、今村 理世、塩谷 天、荒井 怜奈、小島 宏建、岡部 隆義、長野 哲雄、井上 英史、藤川 雄太、湯本 史明、千田 俊哉、丹羽 隆介
  • 学会等名: 第19回日本蛋白質科学会年会 第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会
• [備考] 筑波大学 生存ダイナミクス研究センター 丹羽プロジェクト
  • URL: https://www1.tara.tsukuba.ac.jp/projects/niwa/