| 研究課題/領域番号 |
18K19164
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| 研究機関 | 埼玉大学 |
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研究代表者 |
川合 真紀 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (10332595)
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| 研究分担者 |
長野 稔 立命館大学, 生命科学部, 助教 (80598251)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| キーワード | マイクロドメイン |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、植物の脂質をターゲットとした新規のマイクロドメイン可視化プローブを開発することを目的としている。マイクロドメインは細胞膜上に点在する微小な脂質・タンパク質集積ドメインで、植物免疫に関与することが明らかになっている。しかし、これまでに植物特有の脂質で形成される植物マイクロドメインを可視化することができなかったため、植物免疫におけるマイクロドメインの役割の解明は遅れていた。本研究では、植物マイクロドメインの主要脂質であるグリコシルイノシトールホスホセラミド（GIPC）に結合する毒性タンパク質NLPを改変することにより、植物マイクロドメイン特異的可視化プローブの開発を試みている。
2019年度は、2018年度に作製した結合能を維持したまま無毒化させた変異NLPタンパク質（mNLP）にGFPを融合させたタンパク質を作製し、大腸菌を用いて大量発現させ、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。脂質ブロット解析によりGFP-mNLPのGIPCに対する結合能を調べた結果、GFPなしのmNLPより結合能は低下するものの、GIPCに結合することが明らかになった。続いて、精製したGFP-mNLPをシロイヌナズナに処理したところ、子葉と根の両方において細胞膜上にGFP蛍光を観察することができた。
mNLPを用いて恒常的にマイクロドメインを可視化するシロイヌナズナ形質転換体を作出するために、シグナルペプチド（SP）をN末端に付加したGFP-mNLPをUBQ10プロモーター下で発現させるコンストラクトを作製し、アグロバクテリウムを介してシロイヌナズナに導入した。しかし、T1個体を選抜することができなかった。そこで現在、35Sプロモーター下でSP-GFP-mNLPを発現させるコンストラクトに変更し、アグロバクテリウム感染を再度行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
結合能を有した無毒なmNLPへのGFPの付加と大腸菌を用いた大量発現・精製を可能にし、そのシロイヌナズナへの外部処理により、細胞膜を可視化させることに成功した。ターゲットであるGIPCは細胞膜の細胞外側（外層）に偏在するため、GFP-mNLPはGIPCが集積しているマイクロドメインを可視化していると推察される。その一方、マイクロドメインをより簡便に、且つ詳細に観察するために試みた、恒常的GFP-mNLP発現シロイヌナズナ形質転換体の作出には至らなかった。したがって、やや遅れていると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
恒常的SP-GFP-mNLP発現シロイヌナズナを得るために、p35Sプロモーター下で発現する系統を選抜する。選抜ができれば、様々な組織、及び生育段階における蛍光観察を共焦点レーザー顕微鏡下で行う。また、GFP-mNLPがマイクロドメインを可視化することを実証するために、より詳細に細胞膜を観察することが可能な全反射照明蛍光顕微鏡を用いて観察を行う。さらに、病害処理を行うことにより、病害に応答する際のマイクロドメインの動態についても観察する。これまでに同定されているマイクロドメイン局在性免疫タンパク質を可視化するシロイヌナズナ系統と掛け合わせた系統も整備し、免疫タンパク質とマイクロドメインの動態を比較することにより、植物免疫の制御におけるマイクロドメインの役割を考察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
形質転換植物の確立を、別のプロモーターを用いてやり直しており、観察のため使用する消耗品類の使用が次年度となったため。次年度に使用する予定である。
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