研究課題
本研究の目的は、栄養塩飢餓と強光ストレスで誘導される超オイル細胞を用いて、ω3に代表される機能性脂肪酸やカロテノイドなどの機能性物質を蓄積した細胞工場（クロレラ・ファクトリー）を作り出すことにある。超オイル細胞の代謝メカニズムも研究対象であるが、実用化を意識して細胞工場で製造するものの選別から始める。(1)トレボウクシア藻綱を中心にした網羅的な探索で長鎖不飽和脂肪酸とカロテノイドの潜在的な生産力を調べ、(2)長鎖不飽和脂肪酸の場合は、重イオンビーム照射株を含む突然変異候補株のなかからEPA(20:5)やDHA(22:6)など付加価値の高い脂肪酸を生産する株を選抜する。(3)カロテノイドの場合は、クロレラだけでなくヘマトコッカスも用いてアスタキサンチンをモデルに、強光誘導によらないでカロテノイドの選択的産生が可能かを調べる。こうした誘導方法を超オイル細胞に実施することで、カロテノイドをはじめとする脂溶性物質の細胞工場を構築する。トレボウクシア藻綱に狭義の緑藻を加え分子系統解析を実施することで、（A）トレボウクシア藻綱と他の緑藻綱との関係が、カロテノイドと長鎖不飽和脂肪酸という視点で見えてくる。先行収集したトレボウクシア藻に緑藻を加え合計35株に関しては、強光条件下で12株を選抜して偶数系の超長鎖不飽和脂肪酸に加え奇数系の超長鎖不飽和脂肪酸をもつ株や種の単離が可能か調査している。（B）重イオンビーム照射株を含む突然変異候補株によるEPA(20:5)やDHA(22:6)などの特定脂肪酸株の単離が可能かも調査する。 (i) のシステイン要求性株の単離に加え、(ii) の他の含硫アミノ酸要求株の単離、 (iii) S欠過感受性株あるいは非感受性株の単離に力を入れる。高度不飽和脂肪酸の微量アッセイ系を確立してスクリーニングのハイスループット化をはかる。
2: おおむね順調に進展している
強光下での独立栄養条件に加え、混合栄養と従属栄養条件下での増殖性にも注目している。候補株に関しては、トレボウクシアだけでなく狭義の緑藻も積極的に取り入れることとし、TLC解析に加えGC-MS解析も実施している。パラクロレラでは超オイル細胞化とほぼ同時にカロテノイド組成の劇的変化が起き、ルテインとゼアキサンチンだけで全カロテノイドの90％を占めるようになる。トレボウクシア藻綱のさまざまな種と株で超オイル細胞を誘導し、カロテノイド合成を誘導するとカロテノイドの組成比をさまざまに変えることができる（七色クロレラ）。ヘマトコッカスを含む狭義の緑藻とトレボウクシア藻綱82株の系統樹を作成し強光下での藻体色と比較した。その結果赤やオレンジになるのは狭義の緑藻だけでトレボウクシア藻綱のほとんどは黄色で、カワノリ目は緑のままであることがわかった。狭義の緑藻としてヘマトコッカスに関しては27株、トレボウクシア藻綱に関しても目レベルで網羅的に26株をスクリーニング対象として、弱光と強光両方の独立栄養条件下でのカロテノイド蓄積量とオイルの蓄積量を調べている。完全には網羅されていないが、ヘマトコッカスに関しては27株すべてでアスタキサンチン合成誘導後の蓄積量を調べ、ラマン蛍光フローサイトメーターの結果からスクリーニングの可能性を調査している。超オイル細胞の誘導はこれまで独立栄養条件下の強光条件で実施していたが、今回は混合栄養と従属栄養条件下で光照射条件の緩和が認められないかを収集した162株中61株で調査した。その結果単純な従属栄養培養でも最高で49.4％の油脂含量が記録された。炭素源としては廃糖蜜（モラセス）の利用も考えており、クロレラによるショ糖の取り込みを調べたが問題なく成長することがわかっている。
トレボウクシア藻綱に狭義の緑藻を加え分子系統解析を実施することで、スクリーニング対象となった種や株の系統関係を理解しながら、独立栄養条件だけでなく従属栄養条件や混合栄養条件でも、以下の（A）と（B）の実施を目指している。なお、ヘマトコッカスに関しては、ラマン蛍光を利用したリアルタイム・スクリーニングの可能性も調査する。（A）トレボウクシア藻綱と緑色植物門の他の綱との関係をカロテノイドと長鎖不飽和脂肪酸という視点でスクリーニングを実施する。先行収集したトレボウクシア藻26種に関しては、パラクロレラのように34:1や36:1といった偶数系の超長鎖不飽和脂肪酸に加え、45:1や47:1といった奇数系の超長鎖不飽和脂肪酸をもつ株や種とカロテノイドを文献も含め調査する。（B）重イオンビーム照射に限らず突然変異株をもちいてEPA(20:5)やDHA(22:6)などの特定脂肪酸株の単離が可能かを文献も含め調査する。重イオンビーム照射は高等植物では多くの実績があるが、微細藻類の場合どの核種が脂肪酸のバリエーションを効率よく生み出すかはまだ十分分析されていない。こうした点を解明することで、クロレラ類の高増殖性能と安全性を担保に、世界的にニーズの高い乳幼児向け粉ミルクを含め、機能性表示食品への利用を可能とする。従属栄養条件や混合栄養条件でも優良株が単離できると実用化がさらに促進されるだろう。本研究の最終目的は、（A）と（B）をメインテーマに、(1)長鎖不飽和脂肪酸とカロテノイドの潜在的な生産力を調べ、(2)付加価値の高い特定の脂肪酸を生産する株を単離し、(3)クロレラだけでなくヘマトコッカスも用いて特定カロテノイドの選択的産生が可能かの実証実験を行うことにある。このためには、できるだけ屋内外の閉鎖あるいは開放系バイオリアクターに関する国内外の施設状況を詳しく調査研究する必要がある。
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