| 研究課題/領域番号 |
18K19169
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
折田 和泉 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (70525964)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| キーワード | メタノール資化性菌 / ポリヒドロキシアルカン酸 |
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| 研究実績の概要 |
（1）メタノール中央代謝経路破壊株内での代替資化経路構築
2018年度までに、Methylorubrum extorquensのメタノール中央代謝破壊株にホルムアルデヒドを糖リン酸に固定する代替資化経路の鍵酵素を導入した株を構築し、導入した遺伝子は活性発現しているもののメタノールの資化能は相補しないことを示した。2019年度は構築した発現株のメタボローム解析を実施し、律速となっている反応の推定を試みた。メタボローム解析の結果、代替資化経路導入株ではコントロール株と比較して糖リン酸濃度が低く、代替資化経路の基質となるペントースリン酸の供給が不足していることが予想された。そこで、ペントースリン酸経路または解糖系を強化するために、新たにこれらの経路上の遺伝子と代替資化経路の鍵酵素を共発現するためのプラスミドを構築し、メタノール中央代謝破壊株を形質転換した。しかしいずれの組換え株もメタノール単一炭素の条件では生育しなかった。
２．包括的転写機構改変
σ70をコードするrpoD遺伝子にランダム変異を導入することで包括的に代謝バランスを変化させる「包括的転写機構改変」について、2018年度までに上記の代替資化経路の鍵酵素遺伝子とrpoD遺伝子をタンデムに挿入したプラスミドを作製し、rpoD領域にランダム変異を導入していた。2019年度はランダム変異導入後のプラスミドで形質転換したM. extorquensメタノール中央代謝破壊株をメタノールを単一炭素源とする液体培地での植え継ぎを行った。しかし、メタノール生育能を示した菌株の取得には至らなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2018年度の報告書内で研究計画に追加したメタボローム解析を大阪大学との共同研究により計画通り実施することができた。また、その結果を遺伝子組換えによる代謝改変にフィードバックし、遺伝子発現用のプラスミドを順調に構築することができた。期待通りの結果は得られなかったものの、メタノール資化能の相補に迫る材料とヒントを得られていることから、概ね実施計画通りに研究をすすめられているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでのところ、メタノール資化性の相補には至っていないことから、酵素活性測定、C13メタノールを添加した培地で培養した菌体のメタボローム解析、またポリヒドロキシアルカン酸合成能の解析などによって律速となっている反応の更なる追跡が必要である。
また、メタノールの消費能の強化に寄与したプラスミドにrpoDを導入しランダム変異を導入するといった戦略もとる必要があると考えられる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
50万円を超える備品の購入がなく、機器の修理の必要がなかったため次年度使用分が生じた。
今年度、消耗品の購入のために使用する計画である。
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