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2019 年度 実施状況報告書

膜小胞を細胞外に分泌高生産する新奇細菌における膜小胞形成機構の解明と応用

研究課題

研究課題/領域番号 18K19178
研究機関京都大学

研究代表者

栗原 達夫  京都大学, 化学研究所, 教授 (70243087)

研究期間 (年度) 2018-06-29 – 2021-03-31
キーワード細胞外膜小胞 / タンパク質輸送 / タンパク質分泌 / 表層糖脂質
研究実績の概要

【膜小胞生産を制御するタンパク質の同定】細菌の膜小胞生産性は細胞外環境の影響を受ける。環境への応答にはセンサータンパク質の関与が想定される。そこで、膜小胞高生産性細菌Shewanella vesiculosa HM13の膜小胞中に見出されたセンサータンパク質ホモログHM1275に着目して研究を行った。野生株ではリシン濃度依存的に膜小胞生産性が向上したのに対し、HM1275の欠損株では同等の向上は見られなかった。一方、HM1275はバイオフィルム分散関連タンパク質BdlAと配列相同性を有するため、バイオフィルム分散への関与も調べた。リシン添加条件下で野生株のバイオフィルム形成量はHM1275欠損株に対して有意に減少した。これらの結果から、HM1275が細胞外のリシン濃度を感知し、膜小胞生産およびバイオフィルム分散を誘導するものと考えられた。
【膜小胞へのタンパク質輸送機構の解析】S. vesiculosa HM13の膜小胞の主要な積荷タンパク質P49の膜小胞への輸送機構を解析した。P49が膜小胞表層を認識する可能性が考えられたため、精製P49とP49遺伝子破壊株より単離した膜小胞との結合能をin vitroで評価した。その結果、精製P49の量依存的に膜小胞に結合するP49量が増加した。ゲノム上でP49遺伝子の近傍に存在する遺伝子を破壊した変異株より単離した膜小胞との結合能も評価したところ、細胞表層糖脂質の合成過程において糖脂質前駆体を内膜内葉から外葉へ輸送する機能が推定されたWzxフリッパーゼホモログの遺伝子破壊株から調製した膜小胞にはP49が結合しないことが示された。以上の結果から、P49の膜小胞への輸送には、P49による膜小胞表層糖脂質の認識が重要であり、Wzxフリッパーゼホモログが本表層糖脂質の生合成に関与しているものと考えられた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

膜小胞の生産制御に関与するセンサータンパク質の同定や、in vitroでタンパク質を膜小胞に輸送する再構成実験系の構築、タンパク質の膜小胞移行に関与する因子の同定など、大きな進展があった。一方、膜小胞の基本構造の形成や細胞表層からの出芽・放出を司る因子の同定には至っていないことから、「おおむね順調に進展している」と評価することが妥当と考えられる。

今後の研究の推進方策

遺伝子破壊実験とin vitroタンパク質輸送実験によって、膜小胞へのタンパク質輸送に関与する因子の同定を進める。膜小胞の表層において積荷タンパク質と相互作用する糖脂質を同定し、その構造解析を進める。また、P49をキャリアーとして外来タンパク質を膜小胞に輸送するシステムの開発を進める。一方、膜小胞の基本構造の形成や細胞表層からの出芽・放出を司る因子の同定を目的として、膜小胞中のタンパク質成分の膜小胞形成への関与を調べるとともに、トランスポゾン変異によって膜小胞生産能が変化する変異株を探索する。また、ペプチドグリカンと外膜の架橋を切断する酵素や曲率誘導タンパク質の膜小胞形成への関与も解析する。

次年度使用額が生じた理由

当初、P49遺伝子クラスター遺伝子群の破壊実験とトランスポゾン変異体ライブラリーのハイスループットスクリーニングによって膜小胞へのタンパク質輸送機構の解析や膜小胞形成に関与する因子の同定を進める計画であったが、検討の結果、実験系の変更が必要な状況となった。具体的には、膜小胞へのタンパク質輸送機構の解析に有用なin vitro再構成系を構築できたため、in vivo実験に加えてin vitro実験を行うことで関与する因子の同定を進めることとした。一方、トランスポゾン変異体ライブラリーのスクリーニングにおいては従来法で再現性の高い結果を得ることが困難であったため、新たに開発した膜小胞認識ペプチドを用いたスクリーニングを実施することとした。これらの変更により研究期間が当初計画よりも長くなり、次年度使用額が生じた。これらは上記実験に用いる遺伝子工学用試薬、免疫化学実験用試薬、タンパク質分析用試薬、糖脂質分析用試薬、培養用試薬、プラスチック器具などの消耗品購入に充てる計画である。

  • 研究成果

    (15件)

すべて 2020 2019 その他

すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (11件) (うち国際学会 1件、 招待講演 2件)

  • [国際共同研究] University of Naples “Federico II”(イタリア)

    • 国名
      イタリア
    • 外国機関名
      University of Naples “Federico II”
  • [雑誌論文] Genetic characterization and functional implications of the gene cluster for selective protein transport to extracellular membrane vesicles of Shewanella vesiculosa HM132020

    • 著者名/発表者名
      Kouhei Kamasaka、Jun Kawamoto、Chen Chen、Fumiaki Yokoyama、Tomoya Imai、Takuya Ogawa、Tatsuo Kurihara
    • 雑誌名

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      巻: 526 ページ: 525~531

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2020.03.125

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Isolation of a novel bacterial strain capable of producing abundant extracellular membrane vesicles carrying a single major cargo protein and analysis of its transport mechanism2020

    • 著者名/発表者名
      Chen Chen、Jun Kawamoto、Soichiro Kawai、Akihiro Tame、Chiaki Kato、Tomoya Imai、Tatsuo Kurihara
    • 雑誌名

      Frontiers in Microbiology

      巻: 10 ページ: 3001

    • DOI

      10.3389/fmicb.2019.03001

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Development of a regulatable low-temperature protein expression system using the psychrotrophic bacterium, Shewanella livingstonensis Ac10, as the host2019

    • 著者名/発表者名
      Soichiro Kawai、Jun Kawamoto、Takuya Ogawa、Tatsuo Kurihara
    • 雑誌名

      Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry

      巻: 83 ページ: 2153~2162

    • DOI

      10.1080/09168451.2019.1638754

    • 査読あり
  • [学会発表] Regulation of vesiculation and biofilm dispersion of Shewanella vesiculosa HM13 in response to extracellular environment2020

    • 著者名/発表者名
      Fumiaki Yokoyama、Tomoya Imai、Jun Kawamoto、Takuya Ogawa、Tatsuo Kurihara
    • 学会等名
      3rd Bacterial Cell Biology Conference
    • 国際学会
  • [学会発表] 菌体外膜小胞へのタンパク質輸送における細胞表層構造制御タンパク質の機能2020

    • 著者名/発表者名
      釜阪紘平、陳晨、川本純、小川拓哉、栗原達夫
    • 学会等名
      日本農芸化学会2020年度大会
  • [学会発表] 細菌のセンサータンパク質によるベシクル生産とバイオフィルム分散の誘導2020

    • 著者名/発表者名
      横山文秋、今井友也、川本純、小川拓哉、栗原達夫
    • 学会等名
      日本農芸化学会2020年度大会
  • [学会発表] 膜小胞高生産性細菌におけるタンパク質の膜小胞への輸送機構2020

    • 著者名/発表者名
      栗原達夫
    • 学会等名
      日本農芸化学会2020年度大会
    • 招待講演
  • [学会発表] バイオフィルム分散に関与するセンサータンパク質のホモログを介した細菌ベシクル生産制御2019

    • 著者名/発表者名
      横山文秋、川本純、今井友也、小川拓哉、栗原達夫
    • 学会等名
      第66回日本生化学会近畿支部例会
  • [学会発表] Shewanella sp. HM13 における菌体外膜小胞を介したタンパク質分泌機構における細胞表層構造の働き2019

    • 著者名/発表者名
      釜阪紘平、Chen Chen、Liu Yuying、川本純、小川拓哉、栗原達夫
    • 学会等名
      第66回日本生化学会近畿支部例会
  • [学会発表] バイオフィルム分散関連タンパク質BdlAホモログの細菌ベシクル中からの同定2019

    • 著者名/発表者名
      横山文秋、川本純、小川拓哉、今井友也、栗原達夫
    • 学会等名
      第33回バイオフィルム学会学術集会
  • [学会発表] 細菌生体膜機能発現の分子基盤: 膜リン脂質・膜小胞研究の新展開2019

    • 著者名/発表者名
      栗原達夫
    • 学会等名
      第33回ケミカルバイオロジー研究所セミナー/第105回生物科学フロンティアセミナー
    • 招待講演
  • [学会発表] 細菌の菌体外膜小胞を介した選択的タンパク質分泌における細胞表層構造の役割2019

    • 著者名/発表者名
      釜阪紘平、Chen Chen、小川拓哉、川本純、栗原達夫
    • 学会等名
      第92回日本生化学会大会
  • [学会発表] 細菌の細胞外膜小胞へのタンパク質積み込みにおける膜表層構造の機能2019

    • 著者名/発表者名
      釜阪紘平、陳晨、川本純、小川拓哉、栗原達夫
    • 学会等名
      第20回極限環境生物学会年会
  • [学会発表] 低温菌 Shewanella vesiculosa HM13 のセンサータンパク質によるベシクル生産およびバイオフィルム分散の制御2019

    • 著者名/発表者名
      横山文秋、今井友也、川本純、小川拓哉、栗原達夫
    • 学会等名
      第20回極限環境生物学会年会

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公開日: 2021-01-27  

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