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2019 年度 実施状況報告書

ムギ類卵細胞の人為活性化とRNP-CRISPRによるゲノム編集半数体植物の創出

研究課題

研究課題/領域番号 18K19211
研究機関三重大学

研究代表者

掛田 克行  三重大学, 生物資源学研究科, 教授 (50221867)

研究分担者 岡本 龍史  首都大学東京, 理学研究科, 教授 (50285095)
研究期間 (年度) 2018-06-29 – 2021-03-31
キーワードゲノム編集 / 半数体 / in vitro受精
研究実績の概要

本研究では、ムギ類の遠縁交雑による半数体作出法と受精卵を用いたゲノム編集技術を組み合わせることで斬新なムギ類ゲノム編集技術の確立を目的としている。本年度は、主に下記の4項目について研究を実施した。
1) IVF系を用いたムギ類半数体植物の作出: 前年度にトウモロコシ精細胞とコムギ卵細胞を融合させた交雑受精卵を培養することで半数体コムギを得ることに成功したが、トウモロコシ花は年間を通じた材料調達が難しい。そこで今年度は、通年調達が可能なイネ花から単離したイネ精細胞とコムギ卵細胞を融合させた交雑受精卵を作出・培養することで半数体コムギを得ることが出来るか否か検証を進めた。
2) コムギ、トウモロコシ、イネのセントロメア・テロメア・反復DNA配列の可視化: 昨年度の解析より、トウモロコシ-コムギ交雑受精卵の発生過程においてトウモロコシ染色体・ゲノムの脱落が生じていることが示された。また、イネ-コムギ交雑受精卵においても同様の脱落が生じる可能性が高い。そこで、このゲノム脱落が受精卵のどの発生段階で生じるか明らかにする目的のために、RGEN-ISL法によるコムギ、トウモロコシ、およびイネ染色体の可視化法の確立を試みた。
3) 再生植物のゲノムリシークエンシング: 再生植物体はトウモロコシまたはイネ染色体・ゲノムの一部を保持している可能性があることから、再生植物体のゲノムシークエンシング解析を進めた。
4) PEG-Ca2+法によるコムギ卵細胞および受精卵への物質導入系の確立:前年度にイネ受精卵へのCas9-gRNA RNP導入によるゲノム編集イネ作出が可能であることが示されたので、はトウモロコシ-コムギ交雑受精卵またはイネ-コムギ交雑受精卵のCas9-gRNA RNP処理法の確立を目的として、コムギ卵細胞および受精卵への物質導入系の確立を試みた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

1)IVF系を用いたムギ類半数体植物の作出:イネ精細胞-コムギ卵細胞の交雑受精卵は発生しなかったが、核相を倍にした2nイネ精細胞を用いて作出した交雑受精卵は分裂・増殖を進め、植物体にまで再分化・発生した。再分化個体はほぼコムギの形態であり、フローサイトメトリー解析からコムギの約半分の核内DNA量であることが示された。以上より、当該交雑受精卵の発生過程においてイネ染色体・ゲノムが脱落していると考えられたが、矮性形質を示す個体もあり、再生植物体はイネ染色体・ゲノムの一部を保持している可能性が考えられた。
2)コムギ、トウモロコシ、イネのセントロメア・テロメア・反復DNA配列の可視化:イネ、トウモロコシおよびコムギのゲノムDNA配列情報をRepeatExplorerにより解析および分類し、得られた反復DNA配列情報を参照にRGEN-ISLに用いるcrRNA 44種(コムギ22種、トウモロコシ11種、イネ11種)を設計および合成した。3つの植物種の葉を固定したのちに核抽出を行い、cytospinによりそれら核をスライドガラスに貼り付けたのち、上記の44種のcrRNAを用いてRGEN-ISLを行った。その結果、9種のcrRNA(コムギ2種、トウモロコシ1種、イネ6種)において蛍光シグナルの検出が可能であった。
3)再生植物のゲノムリシークエンシング:コムギ-トウモロコシ交雑受精卵由来の半数性コムギに関してもゲノムリシークエンスを進めたところ、コムギゲノムにトウモロコシゲノム断片が挿入されていることが示唆された。
4)PEG-Ca2+法によるコムギ卵細胞および受精卵への物質導入系の確立:イネ卵細胞またはイネ受精卵と同様の条件でコムギ卵細胞および受精卵へのPEG-Ca2+法によるプラスミドDNAの導入を試みたが、プラスミドDNA由来の蛍光タンパク質の発現の確認には至らなかった。

今後の研究の推進方策

1)コムキ-トウモロコシ交雑受精卵およびコムギ-イネ交雑受精卵由来の植物体におけるゲノム組成: コムキ-トウモロコシ交雑受精卵由来の半数性コムギについては、コムギゲノムへのトウモロコシゲノムDNA小断片の挿入が示唆されたので、挿入断片に対するゲノムPCRを行うことでその挿入を確認する。コムキ-イネ交雑受精卵由来の半数性コムギについては、リシークエンス結果を参考に同様の解析を計画している。
2)コムギ、トウモロコシ、イネのセントロメア・テロメア・反復DNA配列の可視化: 前年度の解析により9種のcrRNA(コムギ2種、トウモロコシ1種、イネ6種)がRGEN-ISL法に利用可能なことが示されたので、今年度は卵細胞、受精卵および初期胚を材料にしたRGEN-ISL解析により、交雑受精卵・胚中におけるトウモロコシおよびイネ染色体(ゲノム)の可視化し、交雑受精卵のどの発生過程においてトウモロコシゲノムあるいはイネゲノムの脱落が生じるか明らかにする。
3)コムギ受精卵への物質導入系の確立: PEG-Ca2+処理時に低濃度のアガロースを添加する、あるいはCa2+濃度を上げるなど、イネ卵細胞・受精卵の系を改変することで、コムギ卵細胞・受精卵への物質導入系を確立する。
4)交雑受精卵のCas9-gRNA RNP処理によるゲノム編集半数体の作出: コムギAP2遺伝子およびDL遺伝子の標的遺伝子ガイドRNAとCas9タンパク質の複合体(Cas9-gRNA RNP)を形成させたのち、コムキ-トウモロコシ交雑受精卵内にPEG-Ca2+法を用いて導入し、その受精卵から植物体を再分化させ、編集ゲノム部位の特定、表現型、倍数性の評価などを行う。さらに、半数体植物のコルヒチン処理により倍加半数体(二倍体)を作出し、自殖種子を得る。さらに、自殖次代植物において、それらの形質評価および編集遺伝子の伝達の確認などを行う。

次年度使用額が生じた理由

本年度は、コムギ卵細胞と、トウモロコシまたはイネ精細胞の遠縁交雑受精卵に由来するコムギ半数体の作出に関して大きな成果が得られたが、これらの交雑受精卵を用いたゲノム編集実験を実施するには至らなかった。この主な原因として、コムギ自体の卵細胞または受精卵への物質導入系が確立されていないため、コムギのRNP-CRISPR法の検討を進められなかったことによる。このため、次年度は、PEG-Ca2+処理の改変によってコムギ卵細胞・受精卵への物質導入系の確立した後、RNP-CRISPR法によるコムギおよび遠縁交雑受精卵のゲノム編集を本格的に実施していく計画である。

  • 研究成果

    (21件)

すべて 2020 2019

すべて 雑誌論文 (10件) (うち国際共著 1件、 査読あり 7件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (11件) (うち国際学会 2件)

  • [雑誌論文] Polyspermy in angiosperms: Its contribution to polyploid formation and speciation2020

    • 著者名/発表者名
      Toda Erika、Okamoto Takashi
    • 雑誌名

      Molecular Reproduction and Development

      巻: 87 ページ: 374~379

    • DOI

      10.1002/mrd.23295

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] In Vitro Production of Zygotes by Electrofusion of Rice Gametes2020

    • 著者名/発表者名
      Rahman Md Hassanur、Toda Erika、Okamoto Takashi
    • 雑誌名

      Methods Mol. Biol.

      巻: 2122 ページ: 257~267

    • DOI

      10.1007/978-1-0716-0342-0_18

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 植物受精卵を用いたゲノム編集2020

    • 著者名/発表者名
      岡本 龍史、戸田絵梨香、加藤 紀夫
    • 雑誌名

      植物の化学調節

      巻: - ページ: -

  • [雑誌論文] イネ受精卵への一過的導入法2020

    • 著者名/発表者名
      加藤 紀夫、戸田絵梨香、岡本 龍史
    • 雑誌名

      進化するゲノム編集

      巻: Ⅱ ページ: -

  • [雑誌論文] イネ受精卵発生過程における雌雄配偶子の機能差および父性アリル依存的遺伝子発現による受精卵の発生誘導2019

    • 著者名/発表者名
      戸田絵梨香、岡本 龍史
    • 雑誌名

      アグリバイオ

      巻: 4月号 ページ: 73-78

  • [雑誌論文] DNA demethylation by ROS1a in rice vegetative cells promotes methylation in sperm2019

    • 著者名/発表者名
      Kim M. Yvonne、Ono Akemi、Scholten Stefan、Kinoshita Tetsu、Zilberman Daniel、Okamoto Takashi、Fischer Robert L.
    • 雑誌名

      Proceedings of the National Academy of Sciences

      巻: 116 ページ: 9652~9657

    • DOI

      10.1073/pnas.1821435116

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Establishment of an In Vitro Fertilization System in Wheat (Triticum aestivumL.)2019

    • 著者名/発表者名
      Maryenti Tety、Kato Norio、Ichikawa Masako、Okamoto Takashi
    • 雑誌名

      Plant and Cell Physiology

      巻: 60 ページ: 835~843

    • DOI

      10.1093/pcp/pcy250

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Sperm Entry into the Egg Cell Induces the Progression of Karyogamy in Rice Zygotes2019

    • 著者名/発表者名
      Ohnishi Yukinosuke、Kokubu Iwao、Kinoshita Tetsu、Okamoto Takashi
    • 雑誌名

      Plant and Cell Physiology

      巻: 60 ページ: 1656~1665

    • DOI

      10.1093/pcp/pcz077

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Expression of Genes from Paternal Alleles in Rice Zygotes and Involvement ofOsASGR-BBML1in Initiation of Zygotic Development2019

    • 著者名/発表者名
      Rahman Md Hassanur、Toda Erika、Kobayashi Masaaki、Kudo Toru、Koshimizu Shizuka、Takahara Mirei、Iwami Momoka、Watanabe Yoriko、Sekimoto Hiroyuki、Yano Kentaro、Okamoto Takashi
    • 雑誌名

      Plant and Cell Physiology

      巻: 60 ページ: 725~737

    • DOI

      10.1093/pcp/pcz030

    • 査読あり
  • [雑誌論文] An efficient DNA- and selectable-marker-free genome-editing system using zygotes in rice2019

    • 著者名/発表者名
      Toda Erika、Koiso Narumi、Takebayashi Arika、Ichikawa Masako、Kiba Takatoshi、Osakabe Keishi、Osakabe Yuriko、Sakakibara Hitoshi、Kato Norio、Okamoto Takashi
    • 雑誌名

      Nature Plants

      巻: 5 ページ: 363~368

    • DOI

      10.1038/s41477-019-0386-z

    • 査読あり
  • [学会発表] Initiation of zygotic development and fertilization-independent egg division in rice. Symposium of Frontiers of research on embryo and endosperm development: Induction of artificial apomixis.2020

    • 著者名/発表者名
      Okamoto T.
    • 学会等名
      日本植物生理学会
  • [学会発表] ROS-level dynamics during development of zygote in rice2020

    • 著者名/発表者名
      Rattanawong K., Koiso N., Okamoto T.
    • 学会等名
      日本植物生理学会
  • [学会発表] Accumulation effects of mutations in the wheat AP2 homoeologs on cleistogamous flowering2020

    • 著者名/発表者名
      Nanape A., Watanabe K., Haine H.M., Kakeda K.
    • 学会等名
      日本育種学会
  • [学会発表] イネ受精卵を用いたDNAおよび選抜マーカーフリーなゲノム編集技術の確立2019

    • 著者名/発表者名
      戸田絵梨香
    • 学会等名
      プロジェクト横断型公開シンポジウム「植物のゲノム編集基盤技術開発の現状と展望」
  • [学会発表] Establishment of an in vitro fertilization system in wheat2019

    • 著者名/発表者名
      Maryenti T., Kato N., Ichikawa M., Okamoto T.
    • 学会等名
      ムギ類研究会
  • [学会発表] Accumulation effects of mutant alleles of AP2 homoeologs on cleistogamous flowering in hexaploid wheat2019

    • 著者名/発表者名
      Nanape A., Watanabe K., Haine H., Kakeda K.
    • 学会等名
      ムギ類研究会
  • [学会発表] コムギ-トウモロコシ交雑受精卵の発生過程における片親ゲノムの選択的な脱落2019

    • 著者名/発表者名
      古野真由子, Tety Maryenti, 掛田克行, 岡本龍史
    • 学会等名
      日本植物学会
  • [学会発表] 被子植物の受精に伴う遺伝子発現およびpaternal/maternal mRNA degradation の最初の報告2019

    • 著者名/発表者名
      大西 由之佑,永田 博基,戸田 絵梨香,國分 巌,岡本 龍史,木下 哲
    • 学会等名
      日本植物学会
  • [学会発表] 被子植物の受精に伴うカルシウム応答性遺伝子発現およびmRNA分解2019

    • 著者名/発表者名
      永田 博基,大西 由之佑,戸田 絵梨香,國分 巌,岡本 龍史,木下 哲
    • 学会等名
      日本植物学会
  • [学会発表] An efficient DNA- and selectable-marker-free genome-editing system using zygotes in rice2019

    • 著者名/発表者名
      Toda E, Koiso N, Takebayashi A, Ichikawa M, Kiba T, Osakabe K, Osakabe Y, Sakakibara H, Kato N, Okamoto T.
    • 学会等名
      Vienna International Science Conferences and Events Association, Plant Genome Editing & Genome Engineering
    • 国際学会
  • [学会発表] Gene expression and genome editing systems in rice by direct delivery of macromolecules into egg cell and zygote2019

    • 著者名/発表者名
      Toda E, Koiso N, Takebayashi A, Ichikawa M, Kiba T, Osakabe K, Osakabe Y, Sakakibara H, Kato N, Okamoto T.
    • 学会等名
      EMBO Practical Course “Functional live imaging of plants”
    • 国際学会

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公開日: 2021-01-27  

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