| 研究課題/領域番号 |
18K19211
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| 研究機関 | 三重大学 |
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研究代表者 |
掛田 克行 三重大学, 生物資源学研究科, 教授 (50221867)
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| 研究分担者 |
岡本 龍史 東京都立大学, 理学研究科, 教授 (50285095)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2022-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / 半数体 / in vitro受精 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、ムギ類の遠縁交雑による半数体作出法と受精卵を用いたゲノム編集技術を組み合わせることで斬新なムギ類ゲノム編集技術の確立を目的としてい
る。本年度は、前年度までにイネ受精卵へのCas9-gRNA RNP導入によるゲノム編集イネ作出が可能であることが示されたので、トウモロコシ-コムギ交雑受精卵またはイネ-コムギ交雑受精卵のCas9-gRNA RNP処理法の確立を目的として、コムギ卵細胞および受精卵への物質導入系の確立を試みた。イネ卵細胞またはイネ受精卵と同様の条件でコムギ卵細胞および受精卵へのPEG-Ca2+法によるプラスミドDNAの導入を試みたが、プラスミドDNA由来の蛍光タンパク質の発現の確認には至らなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
コムギ卵細胞と、トウモロコシまたはイネ精細胞の交雑受精卵を用いたゲノム編集実験を実施するには至らなかった。これには、コロナ禍による実験実施の大幅な遅延のため、コムギ自体の卵細胞または受精卵への物質導入系の確立ができず、コムギのRNP-CRISPR法の検討を進められなかったことによる。
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| 今後の研究の推進方策 |
1）コムキ-トウモロコシ交雑受精卵およびコムギ-イネ交雑受精卵由来の植物体におけるゲノム組成: コムキ-トウモロコシ交雑受精卵由来の半数性コムギについては、コムギゲノムへのトウモロコシゲノムDNA小断片の挿入が示唆されたので、挿入断片に対するゲノムPCRを行うことでその挿入を確認する。コムキ-イネ交雑受精卵由来の半数性コムギについては、リシークエンス結果を参考に同様の解析を計画している。
2）コムギ、トウモロコシ、イネのセントロメア・テロメア・反復DNA配列の可視化: 前年度の解析により9種のcrRNA（コムギ2種、トウモロコシ1種、イネ6種）がRGEN-ISL法に利用可能なことが示されたので、今年度は卵細胞、受精卵および初期胚を材料にしたRGEN-ISL解析により、交雑受精卵・胚中におけるトウモロコシおよびイネ染色体（ゲノム）の可視化し、交雑受精卵のどの発生過程においてトウモロコシゲノムあるいはイネゲノムの脱落が生じるか明らかにする。
3）コムギ受精卵への物質導入系の確立: PEG-Ca2+処理時に低濃度のアガロースを添加する、あるいはCa2+濃度を上げるなど、イネ卵細胞・受精卵の系を改変することで、コムギ卵細胞・受精卵への物質導入系を確立する。
4）交雑受精卵のCas9-gRNA RNP処理によるゲノム編集半数体の作出: コムギAP2遺伝子およびDL遺伝子の標的遺伝子ガイドRNAとCas9タンパク質の複合体(Cas9-gRNA RNP)を形成させたのち、コムキ-トウモロコシ交雑受精卵内にPEG-Ca2+法を用いて導入し、その受精卵から植物体を再分化させ、編集ゲノム部位の特定、表現型、倍数性の評価などを行う。さらに、半数体植物のコルヒチン処理により倍加半数体(二倍体)を作出し、自殖種子を得る。さらに、自殖次代植物において、それらの形質評価および編集遺伝子の伝達の確認などを行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コムギ卵細胞と、トウモロコシまたはイネ精細胞の交雑受精卵を用いたゲノム編集実験を実施するには至らなかった。これには、コロナ禍による実験実施の大幅な遅延のため、コムギ自体の卵細胞または受精卵への物質導入系の確立ができず、コムギのRNP-CRISPR法の検討を進められなかったことによる。このため、研究期間を1年間延長し、次年度は、PEG-Ca2+処理の改変によってコムギ卵細胞・受精卵への物質導入系の確立した後、RNP-CRISPR法によるコムギおよび遠縁交雑受精卵のゲノム編集を実施していく計画である。
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