| 研究課題/領域番号 |
18K19219
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| 研究機関 | 立命館大学 |
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研究代表者 |
竹田 篤史 立命館大学, 生命科学部, 教授 (60560779)
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| 研究分担者 |
佐藤 昌直 北海道大学, 農学研究院, 助教 (20517693)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| キーワード | 植物ウイルス / ウイロイド / siRNA / AGO / 遺伝子発現抑制 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、ウイルスおよびウイロイド感染時に生じるsmall-interfering RNA (siRNA)が果たす役割を明らかにすることである。これらのsiRNAが作用しうる標的mRNAを正確に同定するために、AGO1およびAGO2とsiRNAの複合体の標的mRNA認識特異性を明らかにすることを試みている。
令和元年度には、AGO1とAGO2の標的mRNA認識特異性を検証するために以下の実験を行った。
（１）AGO1の標的mRNA認識特異性に関して：タバコにおける一過的なルシフェラーゼアッセイによって、AGO1-small RNAと標的mRNA間にミスマッチとG:U wobbleが生じる場合の遺伝子発現抑制能の検証を完了した。それを踏まえて、網羅的に認識特異性を検証するための超並列レポーターアッセイ系の構築を開始した。標的mRNAプールを作製するためのオリゴDNAの設計を完了し、プラスミドライブラリーを構築した。また、AGO1を標的とするgRNAとCas9を発現する組換えタバコを複数ライン作出した。
（２）AGO2の標的mRNA認識特異性に関して：AGO2-small RNAの標的mRNA認識特異性を検証するために、先行研究に従って、miR390を用いた一過的なルシフェラーゼアッセイを行うこととした。今年度は、タバコにおいて、miR390が取り込まれうる内在性のAGO2およびAGO7をゲノム編集で破壊することを試みた。AGO2を標的とするgRNAとCas9を発現する組換えタバコを複数ライン作出し、AGO2とAGO7を標的とする複数のgRNAとCas9を発現する組換えタバコも複数ライン作出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
AGO1-small RNAの特異性の検証は、おおむね順調に進展している。超並列レポーターアッセイのライブラリー作製にあたり、条件設定に時間を要したが、シークエンスを行う目処がたった。また、AGO1遺伝子をゲノム編集で破壊するための組換えタバコも複数ライン作出できた。AGO1-small RNAの特異性に関する研究はほぼ計画通りに進展している。
他方、AGO2-small RNAの特異性の検証も、おおむね順調に進展している。内在性のAGO7の影響を除去するために、ゲノム編集で破壊するための組換えタバコを複数ライン作出できた。最終年度にゲノム編集個体を選抜し、固定した上で、AGO2-small RNAの特異性検証系の確立に挑戦する計画である。
上述の通り、令和元年度の研究は、ほぼ順調に進展した。以上より、「（２）おおむね順調に進展している」の評価とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和元年度の進捗状況を踏まえて、令和２年度には、以下の実験を行う計画である。
（１）AGO1-small RNAの特異性に関しては、超並列レポーターアッセイの系を確立し、個別行ったレポーターアッセイの結果との間で、データの整合性を検証する。この二つの実験結果の間に強い正の相関が認められた場合、以降の特異性に関する実験は、超並列レポーターアッセイを中心に進めていく計画である。超並列レポーターアッセイの結果をもとに、ウイルス・ウイロイド由来のsiRNAの標的mRNAを予測するためのプログラムを作成する。
（２）AGO2-small RNAの特異性に関しては、AGO7破壊タバコの作出を完了した後、再度、アグロインフィルトレーションによってAGO2依存的な一過的レポーターアッセイによる遺伝子発現抑制の誘導が可能かどうかを検証する。
（３）AGO2を過剰発現するタバコと、Cas9を用いてAGO1およびAGO2がゲノム編集されたタバコを選抜し、固定することを目指す。AGO2発現およびCas9による変異導入を確認した後、自家受精によって外来遺伝子およびCas9による変異を固定する。AGO1変異体をHAタグを付加したAGO1で相補し、AGO2変異体もHAタグを付加したAGO2で相補する。並行して、タバコのAGO1a、AGO1b、AGO2に対する抗血清の特異性を評価する。Cas9による破壊株の作出・固定に成功したら、抗血清の特異性決定のためにも利用する。抗HA抗体、または、各抗血清を利用することで、AGOの免疫沈降実験系を確立する。各AGO中のウイルス・ウイロイド由来siRNAをシークエンスし、標的予測に活用する。
なお、コロナウイルスの影響により、既に実験できない期間が生じている。上記の実験を可能な限り進めていく予定であるが、大きな遅れが見込まれる。
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