| 研究課題/領域番号 |
18K19284
|
|---|
| 研究機関 | 東京大学 |
|---|
研究代表者 |
西増 弘志 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (00467044)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2022-03-31
|
| キーワード | CRISPR |
|---|
| 研究実績の概要 |
CRISPR-Cas獲得免疫機構に関与するRNA依存性DNAヌクレアーゼCas9はガイドRNAと複合体を形成し標的DNAを切断するため、ゲノム編集ツールとして広く利用されている。現在ゲノム編集に利用されているS. pyogenes由来Cas9（SpCas9）はNGGをPAMとして認識する一方、B. laterosporus由来Cas9（BlCas9）はNNNNCという配列をPAMとして認識するため新規のゲノム編集ツールとして期待されている。本年度は、BlCas9のPAM特異性の改変を推進した。BlCas9-sgRNA-標的DNA複合体の結晶構造を基に、BlCas9タンパク質にアミノ酸置換を導入した複数の変異体を作製し、大腸菌を用いて過剰発現させ、NiNTAカラムとイオン交換カラムを用いて精製タンパク質を調製した。精製タンパク質とガイドRNAを用いて、in vitroにおけるDNA切断実験を行い、PAM特異性を変化させるアミノ酸置換を複数同定した。これらのアミノ酸置換を組み合わせたBlCas9改変体を作製し、DNA切断実験を行い、PAM特異性の異なる複数のBlCas9改変体を取得することに成功した。さらに、野生型BlCas9およびBlCas9改変体をガイドRNAとともに哺乳類細胞に導入し、ゲノム編集活性および塩基置換活性を評価した。その結果、複数の標的遺伝子において変異導入を確認することができた。また、BlCas9に加えて、NNGRRTという配列をPAMとして認識する小型のS. aureus由来Cas9（SaCas9）に関しても立体構造に基づくPAM特異性の改変を行い、SaCas9改変体の取得に成功した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
PAM特異性の異なるBlCas9改変体を取得できたため。
|
| 今後の研究の推進方策 |
哺乳類細胞におけるゲノム編集活性の向上したBlCas9改変体を同定する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
BlCas9改変体をさらに最適化する必要が生じたため。
|
