高速原子間力顕微鏡と高度画像解析の融合による近原子分解能AFM画像への挑戦

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19287
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 柴田 幹大 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 准教授 (80631027)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2020-03-31
• キーワード: タンパク質 / バイオイメージング / 原子間力顕微鏡 / 画像解析

研究実績の概要

本研究は、生体分子のダイナミクスを１ナノメートル以下の分解能で撮影できる高速原子間力顕微鏡（高速AFM）を、単粒子解析法やディープラーニングによる画像解析と融合することにより、高速AFM画像の空間分解能をオングストロームまで向上させ、タンパク質部位の揺らぎ・構造変化を定量化できる高度画像解析システムの構築を目指した。
具体的には、単粒子解析ソフトRelion3.0を用い、低温電子顕微鏡画像で成果を上げている様々な解析手法を高速AFM画像へ適用した。最初に、GPUを搭載したサーバーにRelion3.0をインストールし、カルシウムカルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（CaMKII）の高速AFM画像に対して画像解析を行った。CaMKIIの高速AFM動画には、多量体の中心に動きの少ないハブドメインと、その周りに揺らぎの大きなキナーゼドメインが観察される。この動画に対して、MotionCor2を用い、サブナノメートルの精度で約200枚の画像をドリフト補正し積算画像を取得した。その結果、ハブドメインはより鮮明に見えたが、キナーゼドメインはぼやけた画像になることが分かった。これは、タンパク質の動きの少ない部位はさらに空間分解能が上がる一方で、揺らぎの大きな部位は画像を積算することにより、分解能が下がることを意味し、これを利用して、タンパク質内のどの部位が、どの程度の揺らぎを持つのかを定量化することができた。さらに、ディープラーニングソフトウェアを用いて、ハブドメインのセグメンテーションと中心座標の取得、及び、各キナーゼドメインの座標を取得し、ハブドメインとの距離を測ることで、多量体内の各キナーゼドメインの運動や連動性を見出した。このように、高速AFM画像に対して様々な画像解析を適用するシステムを構築したことにより、これまで以上に多くの情報を客観的な解析により引き出せるようになった。

研究成果

• [雑誌論文] Macrocyclic peptide-based inhibition and imaging of hepatocyte growth factor. (2019)
  • 著者名/発表者名: Katsuya Sakai, Toby Passioura, Hiroki Sato, Kenichiro Ito, Hiroki Furuhashi, Masataka Umitsu, Junichi Takagi, Yukinari Kato, Hidefumi Mukai, Shota Warashina, Maki Zouda, Yasuyoshi Watanabe, Seiji Yano, Mikihiro Shibata, Hiroaki Suga*, and Kunio Matsumoto
  • 雑誌名: Nat. Chem. Biol. 巻: 15 ページ: 598-606
  • DOI: 10.1038/s41589-019-0285-7
  • 査読あり
• [雑誌論文] Crystal structure of Heliorhodopsin. (2019)
  • 著者名/発表者名: W. Shihoya, K. Inoue, M. Singh, M. Konno, S. Hososhima, K. Yamashita, K. Ikeda, A. Higuchi, S. Okazaki, T. Izume, M. Hashimoto, R. Mizutori, S. Tomida, Y. Yamauchi, R. Abe-Yoshizumi, K. Katayama, S. P.Tsunoda, M. Shibata, Y. Furutani, A. Pushkarev, O. Beja, T. Uchihashi, H. Kandori and O. Nureki
  • 雑誌名: Nature 巻: 574 ページ: 132-136
  • DOI: 10.1038/s41586-019-1604-6
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Signal integration mechanism of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II revealed by High-speed AFM. (2020)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata and Hideji Murakoshi
  • 学会等名: BPS2020 64th Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Nano-scale imaging of biological samples using High-speed Atomic Force Microscopy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata
  • 学会等名: LIIF2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 高速原子間力顕微鏡によるクロマチン動態のナノスケール観察 (2019)
  • 著者名/発表者名: 柴田幹大
  • 学会等名: 第２回クロマチン潜在能領域会議
  • 招待講演
• [学会発表] Visualizing flexibility in protein structures by high-speed atomic force microscopy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata
  • 学会等名: 57th日本生物物理学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] High-speed atomic force microscopy visualization of protein flexibility in action. (2019)
  • 著者名/発表者名: Mikihiro Shibata
  • 学会等名: Joint UBI-NanoLSI workshop TRENDS IN MOLECULAR BIOPHYSICS OF LIVING CELLS
  • 招待講演
• [学会発表] Physicochemical properties of the microbial rhodopsin RxR in the membrane-mimicking molecule styrene maleic acid (SMA) copolymer. (2019)
  • 著者名/発表者名: Tetsuya Ueta, Keiichi Kojima, Tomoya Hino, Mikihiro Shibata, Shingo Nagano & Yuki Sudo
  • 学会等名: 第11回日本生物物理学会 中国四国支部大会
• [学会発表] Structure and biophysical characterization of the heliorhodopsin. (2019)
  • 著者名/発表者名: W. Shihoya, K. Inoue, M. Singh, M. Konno, S. Hososhima, K. Yamashita, K. Ikeda, A. Higuchi, S. Okazaki, T. Izume, M. Hashimoto, R. Mizutori, S. Tomida, Y. Yamauchi, R. Abe-Yoshizumi, K. Katayama, S. P.Tsunoda, M. Shibata, Y. Furutani, A. Pushkarev, O. Beja, T. Uchihashi, H. Kandori and O. Nureki
  • 学会等名: 57th日本生物物理学会年会
• [学会発表] Application of drift elimination method for high-speed AFM images. (2019)
  • 著者名/発表者名: Shotaro Tsujioka, Hideji Murakoshi, and Mikihiro Shibata
  • 学会等名: 57th日本生物物理学会年会
• [学会発表] Mapping of mechanical property on live cell surface by scanning ion conductance microscope. (2019)
  • 著者名/発表者名: Satoko Kitazawa, Linhao Sun, Ayako Housaka, Takahiro Watanabe-Nakayama, Hiroki Konno, Mikihiro Shibata, and Shinji Watanabe
  • 学会等名: 57th日本生物物理学会年会