| 研究課題/領域番号 |
18K19288
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| 研究機関 | 北陸先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
塚原 俊文 北陸先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (60207339)
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| 研究分担者 |
盛 真友 北陸先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 研究員 (90466772)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2020-03-31
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| キーワード | 修飾塩基 / リードスルー / 遺伝コード修復 / 終止コドン / 無細胞翻訳系 / 合成RNA / IRES |
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| 研究実績の概要 |
終止コドンのUをΨ（Pseudouridine）に変換することで終止コドンがリードスルーされることが示されている。本研究はナンセンス変異を原因とする疾患の治療法として、Ψ以外の修飾塩基を用いることで翻訳リードスルーが実現するか否かを検証し、またリードスルー化に有効な修飾塩基を同定することを目標としている。昨年度までにin vitro翻訳系で、終止コドンに修飾塩基を含んだ全合成RNAを用いたタンパク質合成実験系を確立したが、翻訳効率が低いため、実験の再現性に問題があった。本年度は合成RNAの上流にSD（Shine‐Dalgarno）配列を付加することで翻訳効率を改善し、検証可能な実験系を確立することが出来た。具体的にはSD配列RNAと合成RNAを両者に相補的なsplint oligo DNAとRNAリガーゼによって結合させることで、大腸菌由来の無細胞翻訳系での翻訳効率は従来の10倍以上に向上した。同様に、IRES（internal ribosome entry site）配列を合成RNAの上流に結合させることで、哺乳動物由来の無細胞翻訳系でも同様に、再現性良くタンパク質への翻訳確認ができることを確認した。
修飾塩基としてはこれまでに、5-methyl Uおよび5-fluoro Uにin vitro翻訳系での終止コドンではリードスルー現象が発生することを確認した他、新たにAの誘導体であるClitocineに翻訳リードスルー効果を認めた。これらの結果は、終止コドンのAまたはUを部位特異的に修飾することによって、ナンセンス変異を有するmRNAだけを特異的にリードスルーできることを示した。即ち、細胞内で塩基配列特異的にAまたはUを修飾することができればナンセンス変異はリードスルーされ、完全長タンパク質の翻訳が実現できることが示唆され、翻訳リードスルー療法に新しい可能性が拓かれた。
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