| 研究課題/領域番号 |
18K19295
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
栗本 一基 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (20415152)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| キーワード | PGC / エピゲノム / リプログラミング / 始原生殖細胞 |
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| 研究実績の概要 |
平成30年度は、ゲノム全体のDNAメチル化を代表する繰り返し配列の探索を行い、レトロトランスポゾンMERVLを最適の配列として選定した。生体内の生殖細胞や、試験管内再構成した始原生殖細胞に、プロモーターやコード領域など通常ゲノム中に1コピーのみ存在する領域に対するDNAメチル化解析（Bisulfiteアッセイ）に適用するためには、多数の胚または多能性幹細胞からの誘導が必要となり、UHRF1過剰発現によるDNAメチル化の経時変化や、クローン間のバラツキの評価には適さなかった。ゲノム全体のメチル化率を代表する領域の選定によって、UHRF1の過剰発現によるメチル化リプログラミング過程への介入を、より簡便かつ適切に評価するための基盤が整いつつある。
また、ROSA26部位からCREによる組換え依存的にUHRF1を強制発現させるES細胞を、複数株作出した。これらのES細胞は両方のアレルにUHRF1が挿入されており、かつ、始原生殖細胞のトランスジェニック蛍光レポーターを保持しているため、生殖細胞におけるUHRF1過剰発現実験に適している。このES細胞に対してCRE組み替えを行い、UHRF1を恒常的に強制発現するES細胞株を作出した。これらのES細胞株は、2i+LIFを用いた”ground state”条件下で安定的に培養することができた。2i+LIF条件下で培養したES細胞は恒常的に低メチル化状態にあることが知られているが、この状態でUHRF1を強制発現させても、新規メチル化酵素の発現量が変化しない限りDNAメチル化には影響しないと期待される。作出したES細胞が安定培養可能であったことは、当初の期待通り、UHRF1の過剰発現がES細胞自体の生存や増殖に大きく影響しなかったことを示している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ゲノム全体のメチル化を評価するため、従来用いていたよりも良好と期待される指標を選定することができたため。また、UHRF1を過剰発現させられる始原生殖細胞を誘導するためのES細胞株を、実験に十分な数、作出することができたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
作出したES細胞から始原生殖細胞を誘導し、UHRFの過剰発現による影響（遺伝子発現、MERVLのDNAメチル化率）を解析する。またUHRF1は、ES細胞においてタンパク質レベルでの分解による制御を受けることが最近報告されている。生殖細胞で同様の制御がないか、RNA発現レベルとタンパク質レベルを比較して評価する。
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