フォトスイッチ電位センサーの創製

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19299
• 研究機関: 香川大学
• 研究代表者: 藤原 祐一郎 香川大学, 医学部, 教授 (20532980)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2021-03-31
• キーワード: イオンチャネル

研究実績の概要

電位依存性チャネルの電位センサーの構造と動作機構に基づき、新規の光駆動イオンチャネルおよび光駆動膜機能蛋白質を創製することを試みる。高速で光異性化を起こすアゾベンゼンを利用して、電位センサーを動かし、光によるイオンチャネル活性の制御や電位センサーに付加した酵素などの機能分子の制御を行う。分子構造や動作機構に立脚して戦略的に光駆動チャネル・光駆動性膜蛋白を創製するプラットフォームを構築することを目的として本研究を行う。
本年度は、扱いやすい最小ユニットで機能するHvチャネルおよびVSPの電位センサーを対象に実験を進めたうえで、実験ノウハウを確立させ、さらにより大きな電位依存性K+チャネル(shaker)に対象を広げ実験を進めた。構造解析情報を基に、電位センサーがResting構造からActive構造に変化する際に変わる残基間距離を計算した。光異性化距離に相当する残基ペアに、アゾベンゼン誘導体を架橋するためのCys変異を導入して、光駆動できるか試みた。Hvチャネルとshakerチャネルのキメラチャネルを作成し、光駆動できるか試みた。
S3-S4間距離、S2-S4間距離をアゾベンゼンの光異性化によりコントロールすることを試みた。網羅的に多くの変異体コンストラクトを作成し、変異体チャネルをXenopus卵母細胞に発現させ、アゾベンゼン誘導体をスルフヒドリル反応で付加し、光異性化波長を照射し、電気生理学的に測定した。より大きな電位依存性K+チャネル(shaker)では、光で操作することができる電位センサーを得ることが出来なかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本研究費で実験補助員(1名)を雇用し、変異体作成から電流解析まで一連の解析システムを拡張させ、他のチャネルへ解析を拡張させ、解析検討した。

今後の研究の推進方策

本年度は、扱いやすい最小ユニットで機能するHvチャネルおよびVSPの電位センサーで得られた実験ノウハウを拡張させ、さらにより大きな電位依存性K+チャネル(shaker)に対象を広げ実験を進めた。しかしながら、光で操作できる有効な変異体を得ることが出来なかった。期間中に、NMRを用いた電位依存性H+チャネルの立体構造が報告された。補助事業の目的をより精密に達成するために、NMR構造基盤に基づいてフォトスイッチ電位センサーを設計する再現実験を加え理解を深める必要が生じた。次年度は、追加（再現）実験の実施と論文発表のため期間延長して、構造－機能解析・分子計算まで含めて研究を進める。

次年度使用額が生じた理由

当初計画では、電位依存性H+チャネルに光異性化試薬を結合させ、フォトスイッチ電位センサーを創製する研究を完了する予定であった。期間中に、NMRを用いた電位依存性H+チャネルの立体構造が報告された。補助事業の目的をより精密に達成するために、NMR構造基盤に基づいてフォトスイッチ電位センサーを設計する再現実験を加え理解を深める必要が生じた。追加（再現）実験の実施と論文発表のため期間延長を行う。
直接経費（2,440,449円）の使途は以下の通り
物品費：840,000円、旅費：50,000円、人件費：1,500,000円、その他：50,449円

研究成果

• [雑誌論文] The mechanoreceptor DEG‐1 regulates cold tolerance in Caenorhabditis elegans (2020)
  • 著者名/発表者名: Takagaki Natsune、Ohta Akane、Ohnishi Kohei、Kawanabe Akira、Minakuchi Yohei、Toyoda Atsushi、Fujiwara Yuichiro、Kuhara Atsushi
  • 雑誌名: EMBO reports 巻: 21 ページ: e48671
  • DOI: 10.15252/embr.201948671
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Structural and molecular basis of Na+/D-glucose co-transporters hexose specificity (2020)
  • 著者名/発表者名: Kazuyo Kamitori, Yuichiro Fujiwara
  • 雑誌名: The Journal of Physiological Sciences (Supplement1) 巻: 70 ページ: S52
  • 査読あり
• [学会発表] Structural and molecular basis of Na+/D-glucose co-transporters hexose specificity (2020)
  • 著者名/発表者名: Kazuyo Kamitori, Yuichiro Fujiwara
  • 学会等名: 第97回日本生理学会大会
  • 招待講演
• [学会発表] Sugar specificity and structural analyses of Na+/D-glucose co-transporters Could rare sugars be transported via SGLTs? (2019)
  • 著者名/発表者名: Kazuyo Kamitori, Yuichiro Fujiwara
  • 学会等名: 7th International Sciety of Rare Sugars
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 電位依存性プロトンチャネルがpHと膜電位を感じる機構 (2019)
  • 著者名/発表者名: 藤原祐一郎
  • 学会等名: 第11回日本生物物理学会 中国四国支部大会