細胞核内クロマチン立体構造多型解析のための３次元電子顕微鏡像観測技術開発

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19301
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 楯 真一 広島大学, 理学研究科, 教授 (20216998)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2020-03-31
• キーワード: クロマチン構造 / 電子顕微鏡 / APEX

研究実績の概要

分裂酵母細胞核内にあるクロマチン構造の電子顕微鏡像を観測するために，ヒストンH2B-APEX融合タンパク質を発現する細胞株を構築した．H2B-APEX融合タンパク質を発現する酵母細胞に対して，化学固定，細胞壁破壊，diaminobenzidine(DAB)の細胞内導入，H2O2添加による細胞内DAB-重合反応の各ステップを最適化した．特にDABを細胞内に導入する過程では，DABに対するカウンターイオンを替えることにより，これまでの倍量のDABを細胞内に導入することが可能になった．この結果，これまでのサンプルよりも，約2倍のコントラストをもつクロマチン電子顕微鏡像の観測が可能になった．
細胞内構造を化学固定するための，細胞内化学架橋反応条件の最適化も進めた．導電染色する前段階では，細胞構造をインタクトの状態に保持するために化学固定する．しかし，化学固定の過程では核内構造に歪みが生じることがあるために，核内構造ダメージが最も少ない条件で細胞内構造を固定する条件の検討が必要であった．急速凍結して脱水する方法（物理固定），急速凍結してから徐々に化学固定する方法（cryo-fixation)を試みた．最終的に，反応条件を最適化することでcryo-fixationにより細胞内構造の歪みの少ない最適なサンプル調製に成功した．
今期の研究により，FIB-SEMによる3次元電子顕微鏡観測に十分なコントラストを与える核内クロマチンの導電染色法を構築した．
2年目の研究では，FIB-SEMによる3次元電子顕微鏡像観測に研究を進め，核内クロマチン構造の細胞ごとの違いを観測する．

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

細胞内構造の歪みを最小限に抑える細胞固定化技術，高コントラストのクロマチン電子顕微鏡像を得るための導電染色技術の2つの技術の確立が，研究を進める上での最も大きな懸案であった．当初期待していたよりも，良い状態のサンプル調製が実現できた．

今後の研究の推進方策

今期で確立した試料調製技術を用いて，複数の分裂酵母細胞を用いてFIB-SEM像を取得する．細胞毎に異なるクロマチン構造の変化を電子顕微鏡像として観測する．同時に，既に構築しているクロマチン構造・動態モデルを用いて，FIB-SEM電子顕微鏡像からクロマチンの3次元立体像の再構築を試みる．

次年度使用額が生じた理由

核内クロマチンの導電染色技術の構築が計画よりも少ない試行錯誤で完了したため，遺伝子操作試薬や酵母細胞培養のための試薬代が計画よりも少なくなった．
初年度残額分の予算は，2年目のFIB-SEM使用料に充てることで，より多くのクロマチン電子顕微鏡像を集積する．

研究成果

• [国際共同研究] NIH(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: NIH
• [雑誌論文] DOPG small unilamellar vesicles function as nano-carriers targeting the clustered lectin-like oxidized LDL receptor (LOX-1) on the cell surface (2019)
  • 著者名/発表者名: Ohta,T., Yamada,R., Fujita,S., Takahata,T., Shiba,K., Machida,S., and Tate,S.
  • 雑誌名: J. Drug Delivery Sci. and Tech. 巻: 51 ページ: 327-336
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.jddst.2019.03.014
  • 査読あり
• [雑誌論文] Spindle pole body movement is affected by glucose and ammonium chloride in fission yeast (2019)
  • 著者名/発表者名: Ito,H., Sugawara,T., Shinkai,S., Mizukawa,S., Kondo,A., Senda,H., Sawai,K., Suzuki,S.,Takaine,M., Yoshida,S., Imamura,H., Kitamura,K., Namba,T., Tate,S., and Ueno,M.
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 511 ページ: 820-825
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2019.02.128
  • 査読あり
• [雑誌論文] Backbone and side-chain chemical shift assignments of full-length, apo, human Pin1, a phosphorprotein regulator with interdomain allostery (2019)
  • 著者名/発表者名: Born,A., Nichols,P.J., Henen,M.A., Chi,C.N., Strotz,D., Bayer,P., Tate,S., Peng,J.W., Vogeli,B.
  • 雑誌名: Biomolecular NMR Assignments 巻: 13 ページ: 85-89
  • DOI: https://doi.org/10.1007/s12104-018-9857-9
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] he trans isomer of Tau peptide is prone to aggregate, and the WW domain of Pin1 drastically decreases its aggregation (2019)
  • 著者名/発表者名: Ikura,T., Tochio,N., Kawasaki,R., Matsuzaki,M., Narita,A., Kikumoto,M., Utsunomiya-Tate,N., Tate,S., and Ito,N.
  • 雑誌名: FEBS Letters 巻: 592 ページ: 3082-3091
  • DOI: https://doi.org/10.1002/1873-3468.13218
  • 査読あり
• [雑誌論文] Use of a right triable chip and its engraved shape as a transferrable x-y coordiante system from light microscopy to electron microscopy (2018)
  • 著者名/発表者名: Saito,M., Hiratoko,S., Fukuba,I., Tate,S., and Matsuoka,H.
  • 雑誌名: Electrochemistry 巻: 86 ページ: 6-9
  • DOI: https://doi.org/10.5796/electrochemistry.17-00058
  • 査読あり
• [雑誌論文] Substrate Binding Switches the Conformation at the Lynchpin Site in the Substrate-Binding Domain of Human Hsp70 to Enable Allosteric Interdomain Communication (2018)
  • 著者名/発表者名: Umehara Kohei、Hoshikawa Miho、Tochio Naoya、Tate Shin-ichi
  • 雑誌名: Molecules 巻: 23 ページ: 528～528
  • DOI: https://doi.org/10.3390/molecules23030528
  • 査読あり
• [学会発表] Multiple-phosphorylation to IDR in the chromatin remodeler FACT shows an ‘ultra-sensitive response’ in its nucleosome binding (2019)
  • 著者名/発表者名: Shin-ichi Tate
  • 学会等名: BPS2019
  • 国際学会
• [学会発表] Chromatin structure and dynamics in fission yeast (2019)
  • 著者名/発表者名: Shin-ichi Tate
  • 学会等名: The 1st Seoul National University-Hiroshima University Collaborative Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Structure and dynamics of intrinsically disordered proteins (IDPs) ; a hidden story of protein science (2018)
  • 著者名/発表者名: Shin-ichi Tate
  • 学会等名: BK21-MSRI Special Seminar
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Multiple-phosphorylation in the IDR in chromatin remodeler FACT tunes its remodeling activity (2018)
  • 著者名/発表者名: Shin-ichi Tate
  • 学会等名: he 9th KRIBB ASIA-PACIFC IDP SYMPOSIUM
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Intrinsically disordered proteins (IDPs) that constitute the other side of protein structure-function relations (2018)
  • 著者名/発表者名: Shin-ichi Tate
  • 学会等名: The 9th International Conference on Green Technology
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Dynamic allostery in the interdomain dynamics of protein (2018)
  • 著者名/発表者名: Shin-ichi Tate
  • 学会等名: Seminar Series in CMRS Institut des Sciences Analytiques
  • 招待講演
• [学会発表] Dynamic allostery in folded protein and intrinsically disordered protein (IDP) (2018)
  • 著者名/発表者名: Shin-ichi Tate
  • 学会等名: 第56回 日本生物物理学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] Functional roles of dynamic state transition among the conformational ensembles of protein mediated by intrinsically disordered regions (IDRs) (2018)
  • 著者名/発表者名: Shin-ichi Tate
  • 学会等名: 第91回 日本生化学会大会
  • 招待講演
• [図書] Experimental Approaches of NMR Spectroscopy, Akira Naito (Ed.) (2018)
  • 著者名/発表者名: Shin-ichi Tate (Chapter 22)
  • 総ページ数: 636
  • 出版者: Springer Singapore
  • ISBN: 978-981-10-5965-0
• [備考] Molecular Biophysics Lab.
  • URL: http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/biophys/index.html