鳥類の性決定にはたらくnon-coding RNAの解析

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19317
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 黒岩 麻里 北海道大学, 理学研究院, 教授 (20372261)
• 研究分担者: 水島 秀成 北海道大学, 理学研究院, 助教 (20515382)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2020-03-31
• キーワード: ウズラ / Z染色体

研究実績の概要

鳥類は一般的に、性染色体の構成がZZ型でオス、ZW型でメスとなる。したがって、鳥類は遺伝的に性が決定されるが、その性決定遺伝子については未解明な点が多い。Z染色体上に存在する雄性（精巣）決定遺伝子については、有力な候補遺伝子がすでに報告されている。一方で、古くからW染色体上にも雌性（卵巣）決定遺伝子があると考えられているが、未だ同定にいたっていない。その理由として、研究代表者は、雌性を決定しているのはタンパク質をコードした遺伝子ではなく、W染色体上のnon-coding RNA (ncRNA) が性決定に関与しているからではないかと着想した。そこで本研究は、鳥類の性決定メカニズムを明らかにすることを目的として、性決定に働くW染色体上のncRNAを同定し、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集を行い、ノックアウトによる機能消失およびレトロウィウスベクターを用いたノックインによる機能付与を行い、同定されたncRNAの機能解明を目指す。鳥類の性決定メカニズムを明らかにすることは、基礎生物学分野に重要な知見を与えるのみならず、家禽産業にも直結する重要な応用研究へとつながるものであり、その分子メカニズムを解明することは、当該分野の命題である。しかし、ニワトリの遺伝子導入やゲノム編集実験は長い時間を要し、解析が極めて困難である。そこで、これらの難題を克服すべく、繁殖周期の短いニホンウズラを用いた研究を計画し、鳥類では困難とされている機能解析を実現する。

現在までの達成度 (区分)

4: 遅れている

理由

ウズラの性決定時期を特定するために、7種類の性分化関連遺伝子 (DMRT1, SOX9, AMH, HEMGN, FOXL2, CYP19A1, NR5A1) の発現様式を、5つの発生ステージ (HH27, 29, 31, 34, 38) における雌雄の生殖腺を用いて、RT-PCRおよび生殖腺切片を用いたin situ ハイブリダイゼーションを行った。その結果、各遺伝子の発現様式を確認するとともに、性決定時期はHH26以前であることを推定した。この結果をもとに、性決定直後のHH26-28胚と、性分化が進行したHH30-32胚の生殖腺を雌雄ごとにサンプリングし、RNAを抽出してHi-seq3000によりRNA-seq解析を行った。得られた転写産物のうち、ZW型のメスのみで発現しており、さらに性決定直後のHH-26-28胚に転写量が多いものを、情報解析により選定した。その結果、74種類の転写産物を得た。このうち、タンパク質をコードした遺伝子を24種類、ncRNAを8種類確認した。さらに、このうち少なくとも4種類のncRNA配列はW染色体上に存在することを確認した。

今後の研究の推進方策

RNA-seq解析により選定された74種類の転写産物すべてについて、タンパク質をコードした遺伝子であるのか、あるいはncRNAであるのかを確認する。ncRNAであると予想されたものについては、染色体上の位置とその配列を決定する。さらに、定量的PCRにより性決定時期およびそれ以降の発生ステージでの発現様式を確認し、in situハイブリダイゼーションにより、生殖腺おける発現の局在を確認する。以上の実験から、性決定に関与する可能性が得られた転写産物については、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集実験を行い、ノックアウトウズラを作製し、その表現型を解析する。

次年度使用額が生じた理由

2018年9月に起きた北海道胆振東部地震により、研究代表者の研究室ではおよそ３日間の停電が続き、実験に使用する予定であった凍結組織サンプルおよびRNA等のほとんどが失われてしまった。そのため、サンプリングをやり直すこととなり、実験計画に遅れが生じたため、次年度使用額が生じた。

研究成果

• [学会発表] ニホンウズラにおける新規性決定遺伝子の探索とゲノム編集技術の確立 (2018)
  • 著者名/発表者名: 宮本淳太郎、奥野未来、伊藤武彦、水島秀成、黒岩麻里
  • 学会等名: 「先進ゲノム支援」拡大班会議