失われた野性味から明らかにする自然環境特異的な生体調節のメカニズム

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19323
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 神田 真司 東京大学, 大気海洋研究所, 准教授 (50634284)
• 研究分担者: 安齋 賢 基礎生物学研究所, バイオリソース研究室, 助教 (20779467) ; 馬谷 千恵 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (60779346) ; 兵藤 晋 東京大学, 大気海洋研究所, 教授 (40222244)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2021-03-31
• キーワード: 定量PCR / ストレス / リアルタイムPCR

研究実績の概要

本年度はd-rR メダカと野生メダカのF1ハイブリッドそして F2ハイブリッドを作成した。 まず、F0個体の各種表現型を解析したところ、当初の期待通り、d-rR メダカと野生メダカは様々な表現型の違いを表していた。これらの見た目で観察された表現型を、それぞれ定量し、解析したところ、成長や繁殖・ストレスなど、様々な表現型において有意に差があることが分かった。そこでF2ハイブリッドを用いて同様の表現型解析を行ったところ、ちょうどd-rR メダカと野生メダカの間を取るような表現型の分布を示したため、本研究で期待しているような遺伝子による表現型の差が出ているという事が強く示唆された。本年度は、この表現型をさらに遺伝子型の解析として行うために、各種実験系の整備及びゲノム解析に向けたゲノム抽出の条件検討、最適なシーケンス法の検討を行った。現在、両系統のF0世代および200匹以上のF2ハイブリッドの表現型解析を終えており、これから最適な条件でのゲノム抽出・サンプル調製を行い、次世代シーケンサーによるすべての個体のゲノム解析を行う段階にさしかかっている。また、F2個体をさらに増やし、表現型解析も続けている。これらの解析および次世代シーケンサーによるシーケンスの後には、今回明らかにした表現型に関与する遺伝子座の決定がなされると期待される。これまでに研究分担者のそれぞれの技術をいかし、密に連携した研究ができ、概ね順調に進展していると考えている。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の予定通り、d-rR メダカと野生メダカのF0、 F1ハイブリッドそして F2ハイブリッドを作成した。F0および F2ハイブリッドの200個体以上から、様々な表現型を抽出し、全て定量化した。死亡した個体は放置するとDNAがシーケンスに耐えないクオリティになってしまうというトラブルによって、表現型定量を再度を取り直さなければならない状況になったが、2回目の表現型定量も成功し、ゲノムシーケンスに向けての準備は万全である。反省点としてスモールスケールで最後まで実験をやっておけば定量した貴重なデータを無駄にせずに済んだと考えている。ただし、このクオリティの低くなってしまったゲノム DNA に関しても、AmpliconSeqなどの多少ゲノム DNA のクオリティーが低い場合でも適用できるようなシーケンス法を用いることによって解析を行う予定である。今後次世代シーケンサーを用いたF2ハイブリッド200個体以上のシーケンス解析により、野生メダカと d-rR メダカの表現形の違いをもたらす遺伝子座の解析が進んでいくと期待される。またコルチゾールなどストレス応答ホルモンのELISA実験系やリアルタイム PCR による各種脳下垂体遺伝子の発現定量系も順調に立ち上がったので今後のホルモン発現量存在量の定量に向けた準備も万端である。
以上の進捗により3年間の計画で成果が得られるための1年目の進捗は得られている。研究計画開始から実験まで代表者・分担者間でも密に連携が取れており、概ね順調に進展していると考えている。

今後の研究の推進方策

これまでにF0個体のd-rR/野生メダカの表現型の間の形質をF2ハイブリッドが表すような傾向がみられている。したがってこれら表現型はそれぞれの F0のゲノム遺伝子によるものであると強く示唆される。
Amplicon Seqや DD rad seqなどの少ないrun数で効率的にゲノムをシーケンスできるような方法で、すべての個体の遺伝子座の遺伝子型を決定していく。最終的なQTL解析における遺伝子座の決定には200個体では少ない可能性が考えられるので、 現在新たな F 2世代を作成し再度同一の表現型について追試を行っている。また脳下垂体の各種ホルモン遺伝子についての発現についても F0個体を用いて解析し、これに差異が存在すれば F2個体でのリアルタイムPCR 法による解析を行い、こちらについてもQTL解析での遺伝子座の探索を行う。
これらのQTL 解析を統合して考え、野生メダカーd-rR間の各種表現系の差異に関与する遺伝子座をそれぞれ決定予定である。QTL解析により遺伝子座を決定することができた暁には、近傍に存在する遺伝子それぞれについてF1ハイブリッドを用いたallele specific expression 解析をはじめとする様々な解析手法を用いて、実際にその表現型に関与する遺伝子そのものの決定を行う予定である。

次年度使用額が生じた理由

本年度は実験系の立ち上げと、サンプリングの作業に主に注力したため、もっともコストのかかる次世代シーケンスを１度しか走らせていないため、次年度使用額が生じた。効率的に実験自体は進められているので、最終年度までにまとまったデータが得らられる期待に変わりはない。

研究成果

• [雑誌論文] Evolution of the regulatory mechanism for hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates - hypothesis from a comparative view. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kanda S
  • 雑誌名: General and comparative endocrinology 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1016/j.ygcen.2018.11.014
  • 査読あり
• [雑誌論文] Shark genomes provide insights into elasmobranch evolution and the origin of vertebrates. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hara Y, Yamaguchi K, Onimaru K, Kadota M, Koyanagi M, Keeley SD, Tatsumi K, Tanaka K, Motone F, Kageyama Y, Nozu R, Adachi N, Nishimura O, Nakagawa R, Tanegashima C, Kiyatake I, Matsumoto R, Murakumo K, Nishida K, Terakita A, Kuratani S, Sato K, Hyodo S and Kuraku S
  • 雑誌名: Nature Ecology and Evolution 巻: 2 ページ: 1761-1771
  • DOI: 10.1038/s41559-018-0673-5
  • 査読あり
• [学会発表] Role of GnRH in the gonadotropin release: changes during vertebrate evolution (2018)
  • 著者名/発表者名: Kanda S, Kayo D, Fujimori C, Takahashi A, Oka Y
  • 学会等名: Asia and Oceania Society for Comparative Endocrinology Intercongress (AOSCE)
  • 招待講演
• [学会発表] The role of estrogen receptor β1 (Esr2a) in the negative feedback regulation of follicle stimulating hormone by 17β-Estradiol in a teleost medaka (2018)
  • 著者名/発表者名: Kayo D, Kanda S, Oka Y
  • 学会等名: Asia and Oceania Society for Comparative Endocrinology Intercongress (AOSCE)
• [学会発表] 脊椎動物の脳下垂体におけるFSH・LH産生細胞の発現分化の進化 (2018)
  • 著者名/発表者名: 藤森千加、松田真以子、竹内雅貴、岡良隆、神田真司
  • 学会等名: 日本動物学会第89回大会
• [学会発表] 真骨魚類メダカにおけるエストロジェン受容体β1（Esr2a）を介した濾胞刺激ホルモン（FSH）のエストロジェンフィードバック機構の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 加用大地、神田真司、善方文太郎、岡良隆
  • 学会等名: 日本動物学会第89回大会
• [学会発表] 繁殖可能な生理状態に同期して性行動を賦活する脳内神経メカニズムの解明 (2018)
  • 著者名/発表者名: 富原壮真、加用大地、神田真司、岡良隆
  • 学会等名: 日本動物学会第89回大会
• [学会発表] 小型の真骨魚類、メダカを対象とした17β-Estradiol投与方法の検討 (2018)
  • 著者名/発表者名: 加用大地、神田真司、岡良隆
  • 学会等名: 第43回日本比較内分泌学会大会
• [学会発表] 糖タンパク質ホルモンFSH・LH・TSHの各サブユニットの発現の進化 (2018)
  • 著者名/発表者名: 藤森千加、松田真以子、岡良隆、神田真司
  • 学会等名: 第43回日本比較内分泌学会大会
• [学会発表] 終神経GnRH ニューロンは幼少期特異的に活発な神経活動を示す (2018)
  • 著者名/発表者名: 馬谷 千恵, 岡良隆
  • 学会等名: 第41回日本神経科学学会大会