中枢概日時計の局所神経回路で２種類の細胞を遺伝子操作・活動操作し分ける方法の開発

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19421
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 三枝 理博 金沢大学, 医学系, 教授 (20296552)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2020-03-31
• キーワード: サーカディアンリズム / 視交叉上核 / アデノ随伴ウイルスベクター / 局所神経ネットワーク / 遺伝子操作マウス / カルシウム / 光遺伝学

研究実績の概要

概日（サーカディアン）リズムを制御する中枢概日時計・視交叉上核（SCN）の神経ネットワークを題材にし、複雑な局所神経ネットワークにおいて、近接する2種類のニューロンタイプに異なる遺伝子操作・神経活動操作を加え、両者間のコミュニケーションをex vivo、 in vivoで様々な角度から記録・解析できるシステムを構築する。具体的には、一方を刺激した時の他方の応答、両者の神経活動の同時測定、上流・下流関係の解析等である。
そのためには、２種類のニューロンタイプに特異的に、異なる外来遺伝子を導入する必要がある。両者がある程度離れた領域に存在する場合には、Cre依存的発現AAVベクターを空間的にインジェクションし分けることが可能である。しかしSCNは小さな神経核なので、AAVベクターを空間的に打ち分けることは不可能である。そこで本研究では、一方のニューロン（VIPニューロン）に特異的にテトラサイクリン制御性トランス活性化因子tTA2を発現するマウスを作製し（VIP-tTA2）、tTA2依存的発現AAVベクターを使ってVIPニューロンに外来遺伝子を発現させる。AVP-Creマウス/Cre依存的発現AAVと組み合わせれば、二種のAAVベクターを一緒にインジェクションすることで、両者に異なる遺伝子を導入できる。
今年度は、VIP-tTA2マウスの作成を行った、CRISPR-Cas9システムを利用してtTA2cDNAをVip遺伝子にin frameでノックインするためのコンストラクトを作成し、マウス受精卵へのインジェクションを行った。現在、ゲノム編集を行った受精卵から発育した仔マウスの誕生を待っており、適当な週齢に達したら正しくノックインされているマウス個体のスクリーニング、tTA2の発現解析などを行っていく。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ほぼ研究計画の通りに、研究が進んでいる。

今後の研究の推進方策

VIP-tTA2マウスの作成を引き続き行う。得られた候補マウスのスクリーニングを行い、正しく遺伝子操作されたマウス個体を選別し、系統を維持する。AVP-Creマウスを交配して得られたマウスのSCNに、Cre依存的AAV発現ベクターとtTA2依存的AAV発現ベクターをインジェクションし、同一個体内でAVPニューロンとVIPニューロンに異なる外来遺伝子を導入する。

次年度使用額が生じた理由

VIP-tTA2マウスのスクリーニングが次年度に持ち越しになったため。

研究成果

• [雑誌論文] Sexually Dimorphic Vasopressin Cells Modulate Social Investigation and Communication in Sex-Specific Ways. (2019)
  • 著者名/発表者名: Rigney N, Whylings J, Mieda M, de Vries G, Petrulis A
  • 雑誌名: eNeuro 巻: 6 ページ: in 0415-18.2019
  • DOI: 10.1523/ENEURO.0415-18.2019
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Glutamatergic neurons in the medial prefrontal cortex mediate the formation and retrieval of cocaine-associated memories in mice. (2019)
  • 著者名/発表者名: Zhang T, Yanagida J, Kamii H, Wada S, Domoto M, Sasase H, Deyama S, Takarada T, Hinoi E, Sakimura K, Yamanaka A, Maejima T, Mieda M, Sakurai T, Nishitani N, Nagayasu K, Kaneko S, Minami M, Kaneda K.
  • 雑誌名: Addict Biol 巻: Epub ahead of print ページ: in press
  • DOI: 10.1111/adb.12723
  • 査読あり
• [雑誌論文] The Network Mechanism of the Central Circadian Pacemaker of the SCN: Do AVP Neurons Play a More Critical Role Than Expected? (2019)
  • 著者名/発表者名: Mieda M.
  • 雑誌名: Front Neurosci 巻: 13 ページ: 139
  • DOI: 10.3389/fnins.2019.00139
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Monoamines Inhibit GABAergic Neurons in Ventrolateral Preoptic Area That Make Direct Synaptic Connections to Hypothalamic Arousal Neurons. (2018)
  • 著者名/発表者名: Saito YC, Maejima T, Nishitani M, Hasegawa E, Yanagawa Y, Mieda M, Sakurai T
  • 雑誌名: J Neurosci 巻: 38 ページ: 6366-6378
  • DOI: 10.1523/JNEUROSCI.2835-17.2018
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Time Restriction of Food Intake During the Circadian Cycle Is a Possible Regulator of Reproductive Function in Postadolescent Female Rats. (2018)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara T, Nakata R, Ono M, Mieda M, Ando H, Daikoku T, Fujiwara H.
  • 雑誌名: Curr Dev Nutr 巻: 3 ページ: nzy093
  • DOI: 10.1093/cdn/nzy093
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 哺乳類中枢概日時計の神経メカニズム (2019)
  • 著者名/発表者名: 三枝理博
  • 学会等名: 明治大学現象数理学共同研究集会
  • 招待講演
• [学会発表] Analysis of the central circadian clock in AVP neuron-specific VGAT deficient mice (2019)
  • 著者名/発表者名: "前島隆司 長谷川恵美 津野祐輔 三枝理博"
  • 学会等名: 第９回アジア・オセアニア生理学会連合（FAOPS）2019年大会
  • 国際学会
• [学会発表] 中枢概日時計におけるバソプレシンニューロンの機能 (2018)
  • 著者名/発表者名: 三枝理博
  • 学会等名: 第４３回日本睡眠学会定期学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] Genetic dissection of neural mechanisms underlying the central circadian pacemaker (2018)
  • 著者名/発表者名: 三枝理博
  • 学会等名: Sapporo Symposium on Biological Rhythm in 2018
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Neural mechanisms underlying the central circadian pacemaker of the SCN (2018)
  • 著者名/発表者名: 三枝理博
  • 学会等名: 第４１回日本神経科学大会
  • 招待講演
• [学会発表] AVP神経特異的小胞GABAトランスポーター遺伝子欠損マウスにおける中枢概日時計の解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: AVP神経特異的小胞GABAトランスポーター遺伝子欠損マウスにおける中枢概日時計の解析
  • 学会等名: 第25回日本時間生物学会学術大会