| 研究課題/領域番号 |
18K19428
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
岡村 康司 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (80201987)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2020-03-31
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| キーワード | 膜電位 / イノシトールリン脂質 / アフリカツメガエル |
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| 研究実績の概要 |
我々はこれまでにアフカリツメガエル卵母細胞をイオンチャネル等の膜蛋白質発現系細胞として使用する実験を行ってきた。その過程において、アフリカツメガエル卵母細胞においては、内因性に、電位依存的にPI(3,4)P2量が増える現象が存在することを見出した。これまで電位依存的に酵素活性が生じる現象は、申請者らの見出した電位依存性ホスファターゼ以外には知られていない。しかし、本酵素活性は申請者らの見出したものとは性質が異なるため、本メカニズムを明らかにすることで、膜電位を基盤とする新規の酵素活性メカニズムが同定できるのことが期待される。加えて我々は、既にアフリカツメガエルと同様の両生類であるアカハライモリの卵母細胞においては、上記電位依存性酵素活性が認められないことを確認している。したがってアフリカツメガエル卵母細胞とアカハライモリ卵母細胞の両者を実験に用い、その生理的、分子生物学的性質を比較、検証することで、この新規の膜電位依存的酵素活性を担う分子の同定が可能となるのではないかと考えた。本研究ではトランスクリプトーム解析と機能的スクリーニングを組み合わせたアプローチをとることで、まずはこの分子実体を同定することを目標とする。加えて、本分子が種を超えてどの程度保存されているのか、どの部位に発現しているのかを検証することで、新規膜電位依存的酵素活性がどの程度重要であるのかについても考察したいと考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度は、アフリカツメガエル卵母細胞で内因性に認められる電位依存性酵素活性が、ホスファターゼ活性によるのか、或いはキナーゼ活性によるのかを同定することを目的とした。
そこでまずはPI(3)P, PI(4)P, PI(3,4,5)P3について、それぞれのプローブをコンストラクションにより作製し、mRNAをアフリカツメガエル卵母細胞へと注入することで、そのシグナルの電位依存的な変化が認められるかを確認した。しかし予想外のことに、いずれのプローブを用いても、シグナルの変化を認めることは出来なかった。その可能性として、(1) 内因性の酵素活性の影響を受ける基質量が、その総量と比較して限られているため、検出できなかった可能性、(2) 各プローブに脂質のアシル基の長さなど何らかの選択性が存在しており、それがシグナルを検出するうえで障害となっている可能性、(3)我々が選択的プローブで見出している現象が、なんらかのartifactであり、現実には PI(3,4)P2の量を反映していない可能性、などが考えられる。
まずは(3)の可能性を否定するため、PI4K阻害剤であるwortmaninの投与実験を行う実験も行った。Wortmaninを投与すると、細胞内の多くのPIPsは枯渇化すると考えられる。このような条件下で再度実験を行うと、内因性の酵素活性は認められなかった。すなわちこの酵素活性は、プローブによる何らかのartifactなどではなく、確かにPIPsの実験系を介していることが明らかとなった。
また、来年度の研究でイモリの卵母細胞を用いるため、繁殖期を迎えたアカハライモリを購入した。
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| 今後の研究の推進方策 |
我々の先行研究において、蛋白質のホスファターゼ活性を阻害するvanadate投与により、アフリカツメガエルにおける内因性酵素活性が消えることが示唆されている。今後はこの実験をもう一度再検証し、本酵素活性がキナーゼ活性によるものでなく、ホスファターゼ活性によるものであることを再確認する。
また、アカハライモリ卵母細胞と、アフリカツメガエル卵母細胞からmRNAを回収し、次世代シーケンスを用いた解析を行うことにより、両者における遺伝子の発現差異を比較する。アフリカツメガエル卵母細胞に発現していて、アカハライモリ卵母細胞に発現していないイノシトールリン脂質に対するホスファターゼ/キナーゼ分子を網羅的に探索する。このなから得られた候補分子に対し、各々のアンチセンスオリゴをアフリカツメガエル卵母細胞に注入することで上記活性が抑えられるかを検証する。これにより対象分子を絞り込む。
また、上記対象分子をクローニングしてmRNAを合成しイモリ卵母細胞へ発現させ、電位依存性酵素活性が生じるかどうかを調べることで、この未知の電位依存的酵素活性の分子実態を解明する。また、この遺伝子が脊椎動物で保存されて存在するかを検証し、保存されている場合には組織での発現分布を調べる。認められた組織に着目し、電位依存的な酵素活性がその組織で存在するかを検証する。既にノックアウトマウスが存在する場合にはノックアウトマウスを入手し、電位依存的酵素活性が消失しているかどうかを確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究室ではアフリカツメガエルを繁殖状態で日常的に飼育しているために年間を通じてアフリカツメガエルの卵母細胞を入手することが出来る。一方で、アカハライモリ卵母細胞を入手するためには繁殖時期に個体を入手する必要がある。しかし、本研究費が使用可能となったころにはアカハライモリの繁殖時期を過ぎてしまっており、このプロジェクトについては次年度まで持ち越すこととなった。
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