T細胞の抗原認識様式のパラダイムシフト樹立を目指した研究およびその展開

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19441
• 研究機関: 富山大学
• 研究代表者: 岸 裕幸 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (60186210)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2020-03-31
• キーワード: T細胞受容体 / MHC/ペプチド複合体 / cis相互作用

研究実績の概要

T細胞はT細胞受容体（TCR）を用いて、標的細胞表面の主要組織適合抗原（MHC）分子に抗原ペプチドが結合した、MHC/ペプチド複合体を認識し活性化される（transの相互作用）。我々は、近年、T細胞上のTCRが同じT細胞上のMHC分子/ペプチド複合体と相互作用してT細胞を活性化する新しい相互作用“cisの相互作用”を見出した。本研究では、TCRとMHC分子/ペプチド複合体との”cisの相互作用“が実際の免疫系で起こりうることを実証し、さらに、”cisの相互作用“を応用した次世代TCR抗原同定法を開発することを目的とした。まず、in vivoでの実験を行うために、T細胞内でdoxycyclineにて自己抗原（OVA）の発現を調節できるシステムを構築した。このベクターを、OVAを認識するOT-I TCRトランスジェニックマウスのTリンパ球に遺伝子導入した。今後、このリンパ球をC57BL/6マウスに移入し、doxycycline投与によりOVAを発現させた時の免疫応答を解析する予定である。また、内在性TCRを発現しないBW T細胞株にOT-I TCRおよびH-2Kb分子を発現させたT細胞株（OT-I_H-2Kb_BW）を作製した。このT細胞株にOVAペプチドをパルスすると、IL-2産生が誘導されることを確認した。この細胞にOVA発現ベクターを遺伝子導入すると、IL-2の産生が誘導される。そこで、インサートを含まない空の発現ベクターに1:105クローンの割合でOVA発現ベクターを混ぜたものを、OT-I_H-2Kb_BW細胞に遺伝子導入し、IL-2の発現を指標にOVA遺伝子導入細胞が濃縮されるかを検証した。その結果、OVA遺伝子の濃縮が観察された。現在、抗原未同定のTCRを用いて、その抗原が同定できるかを検証しようと準備している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

T細胞にて、自己抗原が発現した際、そのT細胞上のMHC分子に抗原ペプチドが提示され、同じ細胞上のTCRが”cisの相互作用”をすることにより、反応すると考えられる。本研究では、TCRとMHC分子/ペプチド複合体との”cisの相互作用“が実際の免疫系で起こりうるかを実証するために、OVAを認識するOT-I TCR T細胞内でdoxycyclineにて自己抗原（OVA）の発現を調節できるシステムをレトロウイルスベクター系を用いて構築した。この発現ベクターはOVAと同時にGFPを発現できるようになっている。このベクターを用いてレトロウイルスを作製し、OVAを認識するOT-I TCRトランスジェニックマウスのTリンパ球に感染させ、遺伝子導入した。今後、このリンパ球をC57BL/6マウスに移入し、doxycycline投与によりOVAを発現させた時の免疫応答を解析する予定である。また、TCRとMHC分子/ペプチド複合体との”cisの相互作用“を用いた、抗原同定法を作製するために、内在性TCRを発現しないBW T細胞株にOT-I TCRおよびH-2Kb分子を発現させたT細胞株（OT-I_H-2Kb_BW）を作製した。このT細胞株にOVAペプチドをパルスすると、IL-2産生が誘導されることを確認した。この細胞にOVA発現ベクターを遺伝子導入すると、IL-2の産生が誘導される。そこで、インサートを含まない空の発現ベクターに1:105クローンの割合でOVA発現ベクターを混ぜたものを、OT-I_H-2Kb_BW細胞に遺伝子導入し、IL-2の発現を指標に細胞をソーティングし、OVA遺伝子導入細胞が濃縮されるかを検証した。その結果、OVA遺伝子の濃縮が観察された。現在、抗原未同定のTCRを用いて、その抗原が同定できるかを検証しようと準備している。

今後の研究の推進方策

TCRとMHC分子/ペプチド複合体との”cisの相互作用“が実際の免疫系で起こりうるかの実証については、doxycyclineにより発現が制御されるOVA遺伝子を導入したOT-I TCRトランスジェニックマウスのTリンパ球をC57BL/6マウスに移入し、doxycycline投与によりOVAを発現させた時の免疫応答を解析する予定である。
また、TCRとMHC分子/ペプチド複合体との”cisの相互作用“を用いた、抗原同定法の作製に向けては、内在性TCRを発現しないBW T細胞株に抗原未同定のTCRを発現させ、標的細胞より作製したcDNAライブラリーを用いて、実際に抗原が同定できるか、検証していく予定である。

次年度使用額が生じた理由

2018年度はマウス及びマイクロウェルアレイチップを使った実験を行わなかったためにマウス及びマイクロウェルアレイチップを購入しなかった。そのために次年度への繰り越しが生じてしまった。2019年度において、マウスおよびマイクロウェルアレイチップの購入に用いる。

研究成果

• [雑誌論文] A novel and simple method to produce large amounts of recombinant soluble peptide/major histocompatibility complex monomers for analysis of antigen-specific human T cell receptors (2019)
  • 著者名/発表者名: Lyu Fulian、Ozawa Tatsuhiko、Hamana Hiroshi、Kobayashi Eiji、Muraguchi Atsushi、Kishi Hiroyuki
  • 雑誌名: New Biotechnology 巻: 49 ページ: 169～177
  • DOI: 10.1016/j.nbt.2018.11.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of Novel HLA Class II-Restricted Neoantigens Derived from Driver Mutations (2019)
  • 著者名/発表者名: Iiizumi Susumu、Ohtake Junya、Murakami Naoko、Kouro Taku、Kawahara Mamoru、Isoda Fumiko、Hamana Hiroshi、Kishi Hiroyuki、Nakamura Norihiro、Sasada Tetsuro
  • 雑誌名: Cancers 巻: 11 ページ: E266
  • DOI: 10.3390/cancers11020266
  • 査読あり
• [雑誌論文] A cloning and expression system to probe T-cell receptor specificity and assess functional avidity to neoantigens (2018)
  • 著者名/発表者名: Hu Z, Anandappa AJ, Sun J, Kim J, Leet DE, Bozym DJ, Chen C, Williams L, Shukla SA, Zhang W, Tabbaa D, Steelman S, Olive O, Livak KJ, Kishi H, Muraguchi A, Guleria I, Stevens J, Lane WJ, Burkhardt UE, Fritsch EF, Neuberg D, Ott PA, Keskin DB, Hacohen N, Wu CJ
  • 雑誌名: Blood 巻: 132 ページ: 1911～1921
  • DOI: 10.1182/blood-2018-04-843763
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Clonally Expanded Decidual Effector Regulatory T Cells Increase in Late Gestation of Normal Pregnancy, but Not in Preeclampsia, in Humans (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsuda Sayaka、Zhang Xiaoxin、Hamana Hiroshi、Shima Tomoko、Ushijima Akemi、Tsuda Kei、Muraguchi Atsushi、Kishi Hiroyuki、Saito Shigeru
  • 雑誌名: Frontiers in Immunology 巻: 9 ページ: 1934
  • DOI: 10.3389/fimmu.2018.01934
  • 査読あり
• [雑誌論文] Introduction of Genetically Modified CD3ζ Improves Proliferation and Persistence of Antigen-Specific CTLs (2018)
  • 著者名/発表者名: Miyao Kotaro、Terakura Seitaro、Okuno Shingo、Julamanee Jakrawadee、Watanabe Keisuke、Hamana Hiroshi、Kishi Hiroyuki、Sakemura Reona、Koyama Daisuke、Goto Tatsunori、Nishida Tetsuya、Murata Makoto、Kiyoi Hitoshi
  • 雑誌名: Cancer Immunology Research 巻: 6 ページ: 733～744
  • DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-17-0538
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of Tumoricidal TCRs from Tumor-Infiltrating Lymphocytes by Single-Cell Analysis (2018)
  • 著者名/発表者名: Shitaoka Kiyomi、Hamana Hiroshi、Kishi Hiroyuki、Hayakawa Yoshihiro、Kobayashi Eiji、Sukegawa Kenta、Piao Xiuhong、Lyu Fulian、Nagata Takuya、Sugiyama Daisuke、Nishikawa Hiroyoshi、Tanemura Atsushi、Katayama Ichiro、Murahashi Mutsunori、Takamatsu Yasushi、Tani Kenzaburo、Ozawa Tatsuhiko、Muraguchi Atsushi
  • 雑誌名: Cancer Immunology Research 巻: 6 ページ: 378～388
  • DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-17-0489
  • 査読あり
• [学会発表] Clonally expanded decidual effector Treg cells increase in late gestation of normal pregnancy, but not in preeclampsia in human. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsuda S, Kishi H, Xiaoxin Z, Shima T, Hamana H, Tsuda K, Ushijima A, Muraguchi A, Saito S.
  • 学会等名: The 38th Annual Meeting of the American Society for Reproductive Immunology
  • 国際学会
• [学会発表] Clonally expanded populations of cytotoxic T cell in tumor infiltrated lymphocyte and peripheral blood in endometrial cancer. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsuda K, Kishi H, Nakashima A, Hamana H, Ushijima A, Tsuda S, Shima T, Shitaoka K, Kobayashi E, Ozawa T, Yoshino O, Saito S.
  • 学会等名: 17th Biennial Meeting of the International Gynecologic Cancer Society
  • 国際学会
• [学会発表] マウス腫瘍細胞株をモデルとした高免疫原性変異抗原の同定とワクチン治療への応用． (2018)
  • 著者名/発表者名: 宮原慶裕，藤井啓介，金関貴幸，鳥越俊彦，山口 類，井元清哉，宮野 悟，浜名 洋，岸 裕幸，珠玖 洋．
  • 学会等名: 第22回日本がん免疫学会学術総会
• [学会発表] T-ISAAC法を用いたペプチド特異的T細胞のTCRレパトア解析． (2018)
  • 著者名/発表者名: 小林栄治，村口 篤，岸 裕幸．
  • 学会等名: 第77回日本癌学会学術総会
• [学会発表] TILでクローナルなT細胞受容体は，腫瘍に対して細胞障害性を示し，腫瘍関連抗原を認識する． (2018)
  • 著者名/発表者名: 下岡清美，浜名 洋，小林栄治，早川芳弘，村口 篤，岸 裕幸．
  • 学会等名: 第77回日本癌学会学術総会
• [学会発表] ヒト大腸がん組織に浸潤する腫瘍反応性CD8陽性T細胞の表現型および遺伝子解析． (2018)
  • 著者名/発表者名: 宮原慶裕，藤井啓介，問山裕二，北嶋貴仁，井上靖浩，浜名 洋，遠藤洋子，楠 正人，井上正宏，岸 裕幸，珠玖 洋．
  • 学会等名: 第77回日本癌学会学術総会
• [学会発表] CTLとTh細胞を共に活性化できる膀胱癌関連抗原に由来する長鎖ペプチドの同定． (2018)
  • 著者名/発表者名: 鶴田未季，平山正敏，Poh Yin Yew，吉村祥子，岸 裕幸，浜名 洋，千住 覚，入江 厚，矢津田旬二，神波大己，江藤正俊，中山秀樹，西村泰治．
  • 学会等名: 第77回日本癌学会学術総会
• [学会発表] 効率的な大腸癌免疫療法の確立に向けた腫瘍浸潤リンパ球レパートリー解析． (2018)
  • 著者名/発表者名: 祐川健太，浜名 洋，下岡清美，小林栄治，北條荘三，奧村知之，長田拓哉，村口 篤，岸 裕幸，藤井 努．
  • 学会等名: 第29回日本消化器癌発生学会総会
• [学会発表] 制御性T細胞のsingle-cell TCRレパートリー解析により示唆された流産と妊娠高血圧腎症の免疫学的病態の相違． (2018)
  • 著者名/発表者名: 津田さやか，チャン シャオシン，浜名 洋，島 友子，牛島明美，津田 桂，村口 篤，岸 裕幸，齋藤 滋．
  • 学会等名: 第33回日本生殖免疫学会総会・学術集会
• [学会発表] 子宮体癌患者における末梢血CD8T細胞のTCRレパートリー解析． (2018)
  • 著者名/発表者名: 津田 桂，岸 裕幸，中島彰俊，浜名 洋，牛島明美，津田さやか，島 友子，下岡清美，小林栄治，小澤龍彦，吉野 修，齋藤 滋．
  • 学会等名: 第33回日本生殖免疫学会総会・学術集会
• [学会発表] 酵母表面ディスプレイ法を用いたTCRの抗原ペプチド/MHCライブラリーの作製とそのスクリーニング． (2018)
  • 著者名/発表者名: 小澤龍彦，大貫 燿，浜名 洋，小林栄治，呂 福蓮，村口 篤，岸 裕幸．
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] TCR repertoire analysis of peptide-specific T cells using immunospot array assay on a chip (T-ISAAC) technology. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi E, Ozawa T, Hamana H, Shitaoka K, Muraguchi A, Kishi H.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] A rapid and simple protocol for cDNA cloning of tumor antigen-specific TCR. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hamana H, Ozawa T, Kobayashi E, Shitaoka K, Muraguchi A, Kishi H.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] The development of antigen detection system using yeast surface display library. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ohnuki Y, Ozawa T, Hamana H, Kobayashi E, Lyu F, Muraguchi A, Kishi H.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] Tumor infiltrating lymphocyte repertoire analysis of colon cancer. (2018)
  • 著者名/発表者名: Sukegawa K, Hamana H, Shitaoka K, Kobayashi E, Saeki S, Nagata T, Fujii T, Muraguchi A, Kishi H.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] Clonally expanded populations of cytotoxic T cell in tumor infiltrated lymphocyte and peripheral blood in uterine endometrial cancer. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsuda K, Kishi H, Nakashima A, Hamana H, Tsuda S, Shima T, Shitaoka K, Kobayashi E, Ozawa T, Muraguchi A, Saito S.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] Development of TCR-antigen identification system using “cis-interaction” of TCR and peptide/MHC complex on a T cell. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi S, Kishi H, Shitaoka K, Hamana H, Kobayashi E, Ozawa T, Muraguchi A.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会