| 研究実績の概要 |
ゲノム編集技術は、パラダイムシフトと呼ぶにふさわしい新たな研究展開を生物学のあらゆる分野にもたらしている。本研究では、ゲノム編集技術(CRISPR)を利用した組織特異的遺伝子ノックアウト法により、発がん抑制機構の１つである組織幹細胞間の競合(Stem Cell competition)解析系確立を目指している。突然変異誘発は、放射線や化学変異原など多様な環境ストレス（DNA損傷ストレス）に共通の最終生物影響である。がん組織、正常組織のゲノム解析から、突然変異誘発が「発がん」の基本要因である事は明らかであるが、一方で、たとえ変異が蓄積していてもがん化を抑制する機構の存在が示唆されている。本研究は、この実体解明の方法論を提案するとともに、関与遺伝子の実証を目指すものであり、組織構築、細胞増殖、がん抑制遺伝子としてそれぞれFat1, Notch1, p53, Bap1遺伝子を対象としている。
本年度は、CRISPRによりFat1、Bap1、p53遺伝子の二重もしくは三重変異体にNotch1変異を導入した変異体の樹立を試みた。Notch1はメダカに2つのオーソログがあるため、両方に変異導入可能なgRNAをそれぞれ設計し、in vitro RNA合成し、Cas9タンパクと共にFat1、BAP1二重変異体ができる掛け合わせもしくはFat1、Bap1、p53三重変異体ができる掛け合わせの受精卵にinjectionし、CRISPRの標的領域付近をPCRで増幅してサンガーシーケンスを行い、変異が導入されていることを確認した。
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