位置運命決定因子におけるヒト成体器官機能制御の解明

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19535
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 土屋 輝一郎 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 准教授 (40376786)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2020-03-31
• キーワード: 位置運命決定因子 / 病変好発部位 / 疾患感受性

研究実績の概要

左右非対称などの臓器位置決定は発生段階で位置運命決定因子により制御されているが、臓器位置が決定し成体となった後でも位置運命決定因子は発現し続けている。しかしながら成体後の位置運命決定因子による制御機能はほとんど解析されておらず、特にヒトにおける作用は全く不明である。申請者が専門としている炎症性腸疾患（IBD）では好発部位が知られており、潰瘍性大腸炎では直腸、クローン病では回腸末端が初発となることが多いが、なぜその部位に発症するか詳細な分子機構は不明である。本研究では、腸管の異なる部位由来のオルガノイドでの位置運命決定因子発現を動揺させることにより細胞機能が置換されることを確認し、位置運命決定因子と疾患感受性の関連を明らかとすることで病変好発部位形成の病態を解明することを目的とする。
1）位置特異的大腸オルガノイド機能解析においては、左側の直腸及び右側の上行結腸より大腸オルガノイドを樹立した。増殖、幹細胞分画、炎症刺激応答、炎症刺激耐性を評価し、上皮細胞機能の部位別差異を解析した。
2）位置運命決定遺伝子の抽出においては、両部位オルガノイドのマイクロアレイにより発現差異を認めた遺伝子を抽出した。
3）位置運命決定遺伝子の確認においては、手術検体組織を用いて、生体組織内でも位置運命決定遺伝子の発現差異が維持されているかを手術検体を用いて、定量PCR及び免疫染色にて確認を行った。
4）位置運命決定遺伝子発現の動揺においては、上行結腸由来オルガノイドにCrisper/CAS9システムを用いて特異的遺伝子を欠失させた。さらに、レンチウイルスを用いて直腸由来オルガノイドに特異的遺伝子を発現させた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の計画通りに、ヒト検体から腸管部位特異的なオルガノイドの樹立に成功している。さらに、マイクロアレイ解析により部位特異的発現遺伝子を同定し、その機能解析まで着手していることから、おおむね順調に進展していると判断した。

今後の研究の推進方策

部位特異的遺伝子の機能解析を行う予定である。部位特異的遺伝子の発現動揺の後、上行結腸由来オルガノイドが直腸由来オルガノイドの細胞機能に置換するか評価する。直腸由来オルガノイドも同様に置換を評価する。特に炎症刺激耐性などIBD病態と関与する機能が置換された場合には病変好発部位との相関を明らかとする。また、マウスへの移植モデルを構築し、in vivoにおける機能置換作用を評価する。最終的には位置運命決定因子を標的とした阻害薬もしくは作動薬を用いて上皮機能作用を確認し新規治療薬候補としての評価を行う予定である。

次年度使用額が生じた理由

理由： 試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため。
使用計画：　検討する数・種類を拡大して解析を行うため、試薬を増量して購入する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] A subset of diffuse-type gastric cancer is susceptible to mTOR inhibitors and checkpoint inhibitors. (2019)
  • 著者名/発表者名: Fukamachi H, Kim SK, Koh J, Lee HS, Sasaki Y, Yamashita K, Nishikawaji T, Shimada S, Akiyama Y, Byeon SJ, Bae DH, Okuno K, Nakagawa M, Tanioka T, Inokuchi M, Kawachi H, Tsuchiya K, Kojima K, Tokino T, Eishi Y, Kim YS, Kim WH, Yuasa Y, Tanaka S.
  • 雑誌名: J Exp Clin Cancer Res. 巻: 38 ページ: 127
  • DOI: 10.1186/s13046-019-1121-3
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Establishment of a system to evaluate the therapeutic effect and the dynamics of an investigational drug on ulcerative colitis using human colonic organoids. (2019)
  • 著者名/発表者名: Nishimura R, Shirasaki T, Tsuchiya K, Miyake Y, Watanabe Y, Hibiya S, Watanabe S, Nakamura T, Watanabe M
  • 雑誌名: J Gastroenterol. 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1007/s00535-018-01540-y
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ubiquitin D is Upregulated by Synergy of Notch Signalling and TNF-α in the Inflamed Intestinal Epithelia of IBD Patients. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kawamoto A, Nagata S, Anzai S, Takahashi J, Kawai M, Hama M, Nogawa D, Yamamoto K, Kuno R, Suzuki K, Shimizu H, Hiraguri Y, Yui S, Oshima S, Tsuchiya K, Nakamura T, Ohtsuka K, Kitagawa M, Okamoto R, Watanabe M.
  • 雑誌名: J Crohns Colitis. 巻: 13 ページ: 495-509
  • DOI: 10.1093/ecco-jcc/jjy180
  • 査読あり
• [雑誌論文] Predictors of mucosal healing during induction therapy in patients with acute moderate-to-severe ulcerative colitis. (2018)
  • 著者名/発表者名: Motobayashi M, Matsuoka K, Takenaka K, Fujii T, Nagahori M, Ohtsuka K, Iwamoto F, Tsuchiya K, Negi M, Eishi Y, Watanabe M.
  • 雑誌名: J Gastroenterol Hepatol. 巻: in press ページ: in press
  • DOI: 10.1111/jgh.14565.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Single cell analysis of Crohn's disease patient-derived small intestinal organoids reveals disease activity-dependent modification of stem cell properties. (2018)
  • 著者名/発表者名: Suzuki K, Murano T, Shimizu H, Ito G, Nakata T, Fujii S, Ishibashi F, Kawamoto A, Anzai S, Kuno R, Kuwabara K, Takahashi J, Hama M, Nagata S, Hiraguri Y, Takenaka K, Yui S, Tsuchiya K, Nakamura T, Ohtsuka K, Watanabe M, Okamoto R.
  • 雑誌名: J Gastroenterol. 巻: 53 ページ: 1035-1047
  • DOI: 10.1007/s00535-018-1437-3
  • 査読あり
• [学会発表] TP53 mutation in human colonic organoids acquires resistance to in vitro long-term inflammation. (2019)
  • 著者名/発表者名: Tsuchiya K, Watanabe S, Shirasaki T, Nishimura R, Katsukura N, Hibiya S, Okamoto R, Nakamura T, Watanabe M
  • 学会等名: ECCO2019
  • 国際学会
• [学会発表] Synergy of Notch signalling and TNF-α in the inflamed intestinal epithelia of IBD patients leads to up-regulation of UBD, a ubiquitin-like protein. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kawamoto A, Nagata S, Anzai S, Takahashi J, Kawai M, Hama M, Nogawa D, Yamamoto K, Kuno R, Suzuki K, Shimizu H, Hiraguri Y, Yui S, Oshima S, Tsuchiya K, Nakamura T, Ohtsuka K, Kitagawa M, Okamoto R, Watanabe M
  • 学会等名: ECCO2019
  • 国際学会
• [学会発表] Lesion-specific gene expression in the Epithelial cells of Crohn’s disease by comparing Small intestinal organoids from active and inactive Lesion in the same patient. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hibiya S, Tsuchiya K, Nishimura R, Shirasaki T, Watanabe S, Katsukura N, Okamoto R, Nakamura T, Watanabe M
  • 学会等名: UEGW 2018
  • 国際学会
• [学会発表] Identification of lesion-specific epithelial function of ulcerative colitis by comparing colonic organoids from lesion and non-lesion parts of same patients. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shirasaki T, Tsuchiya K, Nishimura R, Watanabe S, Hibiya S, Katsukura N, Okamoto R, Nakamura T, Watanabe M
  • 学会等名: DDW 2018
  • 国際学会