| 研究課題/領域番号 |
18K19540
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
秋山 真志 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (60222551)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| キーワード | 遺伝子 / 角化 / 魚鱗癬 / モザイク / 復帰変異 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、先天性魚鱗癬の一種であるichthyosis with confetti（IWC）に着目した。この疾患では、異常な高頻度で「体細胞復帰突然変異によるモザイク現象」（revertant somatic mosaicism, RSM）を生じている。RSMを起こした健常組織は、患者本人の細胞からなり、一般に免疫原性が認められない為、細胞医薬として理想的である。IWCでは、原因遺伝子KRT1、KRT10の特定の領域に変異が集中するが、RSMが高頻度に生じる理由は不明である。本研究では、IWCのモデル細胞系とモデル動物系を世界に先駆けて作成し、それらの系を用いて、RSMの分子的機序の解明を目指した。具体的には、以下の二つのプロジェクトを行った。
(1)不死化ケラチノサイトを用いたIWC皮膚表皮細胞のモデル系とスクリーニングプラットホームの構築：KRT1のゲノムサイズは約4.5kbと小さく、in situでの遺伝子操作に極めて適しているため、KRT1変異によるモデル系の作成を行った。KRT1遺伝子にCRISPR-Cas9によるヘテロ接合性遺伝子変異導入を行い、野生型および変異KRT1を有する不死化ケラチノサイトを作成し、それぞれ異なる蛍光蛋白で標識した。これらのIWCモデル細胞をスクリーニング系として、RSMを促進する条件についてのケミカルクスリーニング、DNAストレス、siRNAスクリーニングなどの各種スクリーニングプラットホームの構築を試みた。
(2)薬剤投与により誘導可能なIWCモデルマウスの作成：CRISPR-Cas9によりKrt1-EGFPノックインマウスの作成を行った。表皮特異的CreER発現マウスは購入し、4-OHT誘導性mRFPおよび変異KRT1発現カセットをCRISPR-Cas9によるゲノム編集によりヘテロ接合性に導入したマウスを、上記２種のマウスと掛け合わせることにより、IWC症状を薬剤誘導性に発症するモデルマウスの作成を試みた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究計画では、KRT1遺伝子の変異をCRISPR-Cas9によりヘテロ接合性に導入し、変異KRT1を有する不死化表皮細胞を作成し、復帰体細胞変異を頻発するモデル細胞をスクリーニング系として樹立する計画であった。しかし、復帰体細胞変異を頻発するモデル細胞が、培養条件のためか、予定通りに樹立できず、復帰体細胞変異を促進する条件についてのスクリーニングプラットホームの構築のための事前調査に想定以上の時間を要した。そのため、研究計画全体に、やや遅れを生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後の研究において、具体的には、以下の二つのプロジェクトを推進する方針である。
(1)不死化ケラチノサイトを用いたIWC皮膚表皮細胞のモデル系とスクリーニングプラットホームの構築：これまでの研究の若干の遅れのため、本研究でのKRT1変異によるモデル細胞系の作成実験の一部が、未施行の状態である。この未施行部分を、令和２年度の前半に行い、KRT1遺伝子にCRISPR-Cas9によるヘテロ接合性遺伝子変異導入を行い、野生型および変異KRT1を有する不死化ケラチノサイトを作成し、それぞれ異なる蛍光蛋白で標識したIWCモデル細胞を完全に樹立する。その細胞をスクリーニング系として、RSMを促進する条件についてのケミカルクスリーニング、DNAストレス、siRNAスクリーニングなどの各種スクリーニングプラットホームを完成させる。
(2)RSM発生の分子機序の解析とRSMの発生を制御しうる低分子化合物の探索：上記モデル細胞系を用いて、種々の条件下でのRSM発生頻度、発生機序を解析する。さらに、低分子化合物ライブラリを用いたスクリーニングにより、RSMの発生を制御しうる低分子化合物を探索する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究計画では、KRT1遺伝子の変異をCRISPR-Cas9によりヘテロ接合性に導入し、変異KRT1を有する不死化表皮細胞を作成し、復帰体細胞変異を頻発するモデル細胞をスクリーニング系として樹立する計画であった。しかし、復帰体細胞変異を頻発するモデル細胞が、培養条件のためか、予定通りに樹立できず、復帰体細胞変異を促進する条件についてのスクリーニングプラットホームの構築に想定以上の時間を要した。そのため、研究計画の進展に遅延を生じ、次年度使用額が発生した。それらの次年度使用額は、不死化ケラチノサイトを用いたIWC皮膚表皮細胞のモデル系とスクリーニングプラットホームの構築と、それらモデル細胞系とスクリーニングプラットホームを用いた、種々の条件下でのRSM発生頻度、発生機序の解析と、低分子化合物ライブラリを用いたスクリーニングに使用する計画である。
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