ギャップ結合遺伝子異常による心臓刺激伝導障害の新たな分子病態の解明

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19550
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 蒔田 直昌 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 教授 (00312356)
• 研究分担者: 西井 明子 (関明子) 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (80408608) ; 柴田 恭明 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 講師 (80253673) ; 本荘 晴朗 名古屋大学, 環境医学研究所, 准教授 (70262912)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2021-03-31
• キーワード: ギャップ結合 / コネキシン45 / 心臓伝導障害 / 歯骨形成異常 / Crispr/Cas9ゲノム編集

研究実績の概要

1. コネキシン40(Cx40)変異Q58LのCrispr/cas9ヘテロノックインマウス(Cx40-Q58L-KI)は作成に成功し、生後8か月まで心電図を経過観察したが、明白な伝導障害はなかった。ヒトと違ってマウスの房室結節には別のコネキシンCx30.2が発現しているため、これがCx40の機能異常を補って、伝導障害を不顕性化している可能性が考えられた。そのためCx30,2のホモノックアウトマウス(Cx30.2-KO)をCRISPR/Cas9で作成し、Cx40-Q58L-KIと交配した(Cx40-KI/Cx30.2-KO)。2系統のマウス（Cx40-Q58L-KI、Cx40-KI/Cx30.2-KO）の遺伝型を確認ののち胚を凍結し、国立循環器病研究センター（国循）に移送した。
2. Cx45の変異R75HノックインマウスもCRISPR/Cas9法で試みたが、sgRNAやオリゴを数回変えて試したが出生しなかった。また、遺伝子編集の簡便化と迅速化を図るため、野生型マウスの自然交配により着床前胚を有する子宮～卵管に核酸とCRISPR/Cas9タンパクを注入し卵管全体に電気穿孔法を行う「iGONAD法」を試みたが、これも無効であった。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

Cx40系統のマウスは確立したが、Cx45変異KIは出生しない。Cx45のホモKOマウスは胎生致死であることが知られているが、マウスでは胎生期の生命維持に重要な役割を担うタンパクのため、ヘテロのミスセンス変異も生まれない可能性がある。

今後の研究の推進方策

1. Cx40の2系統のマウス（Cx40-Q58L-KI, Cx40-KI/Cx30.2-KO)は、2019年7月の国循の新実験動物施設オープン後、凍結胚から個体復元を行い、心電図・電気生理学的解析を行う。
2. Cx45に関しては、新たな手法として、C57BL/JマウスのES細胞にCRISPR/Cas9で遺伝子編集で変異ノックインをおこない、このES細胞を受精直後の受精卵に注射して子宮に戻し、キメラ状態での個体出生を試みる。

次年度使用額が生じた理由

Cx45－KIマウスがこれまでの方法では全く出生しなかったため、その後の機能解析実験が行うことができず次年度使用額が生じた。2019年7月以降、異動先の国循の施設内機関の協力を得てもう一度マウス作成を開始する。

研究成果

• [雑誌論文] Association of Genetic and Clinical Aspects of Congenital Long QT Syndrome With Life-Threatening Arrhythmias in Japanese Patients (2019)
  • 著者名/発表者名: Shimizu W., Makita N. et al
  • 雑誌名: JAMA Cardiol 巻: 4 ページ: 246-254.
  • DOI: 10.1001/jamacardio.2018.4925
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] HCN4 Gene Polymorphisms Are Associated With Occurrence of Tachycardia-Induced Cardiomyopathy in Patients With Atrial Fibrillation (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakano Y., Ochi H., Sairaku A., Onohara Y., Tokuyama T., Motoda C., Matsumura H., Tomomori S., Amioka M., Hironobe N., Ohkubo Y., Okamura S., Makita N., Yoshida Y., Chayama K., Kihara Y.
  • 雑誌名: Circ Genom Precis Med 巻: 11 ページ: e001980.
  • DOI: 10.1161/CIRCGEN.117.001980
  • 査読あり
• [雑誌論文] Clinical Manifestations and Long-Term Mortality in Lamin A/C Mutation Carriers From a Japanese Multicenter Registry (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakajima K., Makita N et al.
  • 雑誌名: Circ J 巻: 82 ページ: 2707-2714.
  • DOI: 10.1253/circj.CJ-18-0339
  • 査読あり
• [雑誌論文] HCN4 pacemaker channels attenuate the parasympathetic response and stabilize the spontaneous firing of the sinoatrial node (2018)
  • 著者名/発表者名: Kozasa Y., Nakashima N., Ito M., Ishikawa T., Kimoto H., Ushijima K., Makita N., Takano M.
  • 雑誌名: J Physiol 巻: 596 ページ: 809-825.
  • DOI: 10.1113/JP275303
  • 査読あり
• [雑誌論文] Lack of genotype-phenotype correlation in Brugada Syndrome and Sudden Arrhythmic Death Syndrome families with reported pathogenic SCN1B variants (2018)
  • 著者名/発表者名: Gray B., Hasdemir C., Ingles J., Aiba T., Makita N., Probst V., Wilde A. A. M., Newbury-Ecob R., Sheppard M. N., Semsarian C., Sy R. W., Behr E. R.
  • 雑誌名: Heart Rhythm 巻: 15 ページ: 1051-1057.
  • DOI: 10.1016/j.hrthm.2018.03.015
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Interaction of phase singularities on the spiral wave tail: reconsideration of capturing the excitable gap (2018)
  • 著者名/発表者名: Tomii Naoki、Yamazaki Masatoshi、Arafune Tatsuhiko、Kamiya Kaichiro、Nakazawa Kazuo、Honjo Haruo、Shibata Nitaro、Sakuma Ichiro
  • 雑誌名: American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology 巻: 315 ページ: H318～H326
  • DOI: 10.1152/ajpheart.00558.2017
  • 査読あり
• [学会発表] 不整脈症候群で心臓が構造的に正常な患者における心筋症の原因遺伝子変異の特定 (2018)
  • 著者名/発表者名: 八木原伸江, 渡部裕, 蒔田直昌, 堀江稔, 清水渉, 大野聖子, 長谷川奏恵, 相庭武司, 田中敏博, 角田達彦, 重水大智, 徹 南野
  • 学会等名: 第82回日本循環器学会学術集会
• [学会発表] CaMKII as a target for novel therapy to treat lethal ventricular tachyarrhythmias. (2018)
  • 著者名/発表者名: 辻幸臣, 蒔田直昌
  • 学会等名: 第57回日本生体医工学学会大会
• [学会発表] CALM2関連性QT延長症候群iPSCモデルにおいて、l-cis-diltiazemは遅延したL型calciumチャネルの不活性化をさらに強める (2018)
  • 著者名/発表者名: 横井文香, 牧山武, 山本雄大, 張田健志, Yimin Wuriyanghai, 早野護, 西内英, 糀谷泰彦, 廣瀬紗也子, 高景山, 大野聖子, 豊田太, 吉田善紀, 蒔田直昌, 堀江稔, 木村剛
  • 学会等名: 第82回日本循環器学会学術集会
• [学会発表] Torsadogenic Action Of Late Na+ Current In Experimental Electrical Storm (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki M., Tsuji Y. , Niwa R., Tomii N., Arafune T., Honjo H., Dobrev D., Nattel S., Kodama I., Sakuma I., Makita N.
  • 学会等名: The 39th Heart Rhythm Society Scientific Sessions
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Single Cell Electrophysiological Analysis of Human iPS Cell-Derived Cardiomyocytes Generated from Long-QT Syndrome Patients Carrying a CALM2 Mutation Using a Membrane Voltage Imaging System (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto Y., Makiyama T, Wuriyanghai Y., Kohjitani H., Hirose S., Gao J, Kashiwa A., Kimura T., Ishikawa T., Motomura H., Makita N, Ohno S., Chonabayashi K., Yoshida Y., Suda K., Horie M
  • 学会等名: The 11th Asia Pacific Heart Rhythm Society Scientific Session
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] The inactivation of L-type Ca2+ Channel was impaired in Human iPS Cell Model of Long-QT Syndrome with CALM2-D134H Mutation. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto Y., Makiyama T., Harita T., Hayano M., Nishiuchi S., Wuriyanghai Y., Kohjitani H., Hirose S., Yokoi F., Ishikawa T., Ohno S., Chonabayashi K., Suda K., Yoshida Y., Horie M., Makita N., Kimura T.
  • 学会等名: 第82回日本循環器学会学術集会
• [学会発表] Duration Predicts Events In Caucasians With E1784K-SCN5A: The E1784K International Consortium (2018)
  • 著者名/発表者名: Wijeyeratne Y. ,Makita N. et al
  • 学会等名: The 39th Heart Rhythm Society Scientific Sessions
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Mechanisms of Electrical Storm Associated With QT Prolongation: Successful Mapping of Torsades de Pointes in Rabbits (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsuji Y., Yamazaki M., Niwa R., Tomii N., Arafune T., Honjo H., Dobrev D., Nattel S., Kodama I., Sakuma I., Makita N
  • 学会等名: American Heart Association Annual Scientific Sessions 2018
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] HCN4 Polymorphisms and Tachycardia Induced Cardiomyopathy (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakano Y., Ochi H., Onohara Y., Sairaku A., Tokuyama T., Motoda C., Matsumura H., Tomomori S., Amioka M., Hironobe N., Ohkubo Y., Okamura S., Makita N., Yoshida Y., Chayama K., Kihara Y.
  • 学会等名: The 65th Annual Meeting of the Japan Heart Rhythm Society
• [学会発表] Clinical Manifestations and Long-term Mortality in Lamin A/C Mutation Carriers from the Japanese Multicenter Registry (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakajima K., Aiba T., Makiyama T., Nishiuchi S., Ohno S., Doi T., Shizuta S., Onoue K., Yagihara N., Ishikawa T., Watanabe I., Oginosawa Y., Nogami A., Aonuma K., Saitoh Y., Kimura T., Makita N., Shimizu W., Horie M., Kusano K.
  • 学会等名: The 65th Annual Meeting of the Japan Heart Rhythm Society
• [学会発表] Genotype-Dependent Differences in Short QT Syndrome (2018)
  • 著者名/発表者名: Makita N.
  • 学会等名: The 11th Asia Pacific Heart Rhythm Society Scientific Session
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Atrial Conduction Defects Caused by a Connexin45 Mutation (2018)
  • 著者名/発表者名: Makita N.
  • 学会等名: The 11th Asia Pacific Heart Rhythm Society Scientific Session
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Novel Arrhythmia Syndrome Associated with Gap Junction Mutations (2018)
  • 著者名/発表者名: Makita N.
  • 学会等名: The 11th Asia Pacific Heart Rhythm Society Scientific Session
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Clinical and Genetic Basis of Calmodulinopathy (2018)
  • 著者名/発表者名: Makita N.
  • 学会等名: The 11th Asia Pacific Heart Rhythm Society Scientific Session
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Pathophysiology of Inherited Arrhythmias Associated with Ca Handling Abnormality (2018)
  • 著者名/発表者名: Makita N.
  • 学会等名: The 65th Annual Meeting of the Japan Heart Rhythm Society
• [学会発表] Mutation Hot-spot-based Risk Stratification In Long QT Syndrome Type 1: Data From A Nationwide Japanese LQT Registry (2018)
  • 著者名/発表者名: Kashiwa A., Aiba T., Makimoto H., Yamagata K. , Keiko S. , Yagihara N., Watanabe H. , Ohno S., Hayashi K. , Sumitomo N., Yoshinaga M. , Morita H., Miyamoto Y. , Makita N. , Horie M., Yasuda S., Kusano K., Shimizu W. , The_Japanese_LQTS_registry_investigators.
  • 学会等名: The 39th Heart Rhythm Society Scientific Sessions
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Cardiac Connexin Syndrome: A New Inherited Cardiac Conduction Disease Entity with Distinct Electrophysiological and Extracardiac Manifestations. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa T., Seki A., Hagiwara N., Makita N.
  • 学会等名: 第82回日本循環器学会学術大会
• [学会発表] Rare Coding Variants in Genes Other Than SCN5A Are Minimal Genetic Burden on the Prognosis of Brugada Syndrome (2018)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa T., Mishima H., Ohno S., T. Aiba, Nakano Y., Aizawa Y., Nakajima T., Hayashi K., Murakoshi N., Yagihara N., Kimoto H., Makiyama T., Watanabe H., Morita H., Yoshiura K., Nogami A., Shimizu W., Horie M., Tanaka T., Makita N.
  • 学会等名: The 65th Annual Meeting of the Japan Heart Rhythm Society
• [学会発表] Lack Of Genotype-phenotype Correlation In Brugada Syndrome And Sudden Arrhythmic Death Syndrome Families With Reported Pathogenic SCN1B Variants (2018)
  • 著者名/発表者名: Gray B. , Hasdemir C. , Ingles J. , Aiba T., Makita N. , PROBST V. , Wilde A., Semsarian C. , Sy R., Behr E.
  • 学会等名: The 39th Heart Rhythm Society Scientific Sessions
  • 国際学会 / 招待講演
• [図書] 不整脈 識る・診る・治す (2018)
  • 著者名/発表者名: 辻幸臣 蒔田直昌（平尾見三、小室一成編）
  • 総ページ数: 376
  • 出版者: 中山書店
  • ISBN: 978-4-521-74585-5
• [図書] 循環器科の心電図 (2018)
  • 著者名/発表者名: 石川泰輔 蒔田直昌（村川 裕二編）
  • 総ページ数: 224
  • 出版者: 南江堂
  • ISBN: 978-4-524-23791-3