肺発生時の二種類の上皮前駆細胞を制御する細胞ダイナミクスと細胞老化機構の解明

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19551
• 研究機関: 宮崎大学
• 研究代表者: 中里 雅光 宮崎大学, 医学部, 教授 (10180267)
• 研究分担者: 柳 重久 宮崎大学, 医学部, 助教 (60404422) ; 坪内 拡伸 宮崎大学, 医学部, 助教 (60573988) ; 松尾 彩子 宮崎大学, 医学部, 医員 (40776332)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2021-03-31
• キーワード: 細胞運命決定

研究実績の概要

発生期における中枢気道と末梢肺組織の上皮前駆細胞内分子の意義を、「細胞ダイナミクスと細胞老化が統制する、幹細胞の運命決定と臓器の形態形成」という独創的な観点から解明し、普遍的な臓器形成プログラムや発生異常に関与する疾患の理解のみならず、生後におこる外界からの損傷からの組織修復・再生機構の理解を飛躍的に前進させ、特発性肺線維症や慢性閉塞性肺疾患等の呼吸器リモデリング疾患やがんの病態解明と、これらの難治性疾患の治療戦略を創出することが本研究の目的である。本年度は、肺上皮細胞特異的Pten欠損マウス、肺上皮細胞特異的Ror2欠損マウス、肺上皮細胞特異的RhoA欠損マウスを作成した。肺上皮細胞特異的Pten欠損マウスは生後21日までに、肺上皮細胞特異的RhoA欠損マウスは生後14日までに全頭死亡した。肺上皮細胞特異的Ror2欠損マウスは胎生致死や生後早期の死亡はみられなかった。肺上皮細胞特異的Pten欠損マウス肺組織では肺胞上皮細胞(TTF1陽性細胞)での細胞増殖停止がみられ、肺胞壁での老化細胞(β-ガラクトシダーゼ活性染色陽性細胞)の増加が見られた。さらに、E18.5での肺上皮細胞特異的Pten欠損マウス肺は肺胞壁へのマクロファージ(F4/80陽性細胞)浸潤とlipoblast(ADRP陽性細胞)と血管内皮細胞(PECAM1陽性細胞)が増加していた。以上のことから、胎生期の肺上皮Pten欠損は、肺上皮細胞での細胞老化と老化関連分泌形質(SASP)を惹起し、間充織の細胞構成を撹乱させることで肺胞形成不全を来し、出生後の死亡を招くことが示唆された。来年度以降、単離肺上皮細胞を用いたRNAシーケンスにより上皮間葉相互作用のトランスクリプトーム解析を行うとともに、老化細胞除去薬によるレスキュー効果を解析する。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究実績の概要にあるように研究計画はほぼ順調に進捗している。

今後の研究の推進方策

1. 肺胞前駆細胞でのPten/RhoA/Ror2欠損が与える肺胞オルガノイド形成能への影響：E18.5マウス肺を用い、肺胞前駆細胞をFACSでソーティングする。PDGFRα陽性間葉細胞とRhoA/Ror2/Pten各遺伝子欠損肺胞前駆細胞をそれぞれマトリゲル上で共培養する。培養21日後でのコロニー数を測定する。コロニー形成能について、サイズを測定する。AT1マーカー(podoplanin, HopX, AQP5)とAT2マーカー(Sftpc)での二重免疫染色を行い、AT2とAT1への分化能の影響を解析する。
2. 肺胞前駆細胞特異的RhoA/Ror2/Pten欠損によるセクレトーム:レセプトームの変化：E18.5マウス肺を用い、肺胞前駆細胞を単離する。各遺伝子欠損マウスの単離肺胞前駆細胞をRNA sequencingにて網羅的に解析する。
3. 老化細胞除去によるレスキュー効果の解析：肺胞前駆細胞RhoA/Ror2/Pten欠損マウスに細胞老化阻害剤(ダサチニブ+クェルセチン)をE12.5より母胎に連日経口投与し、形態形成と分化に対する回復効果を解析する。
4. 肺発生時の細胞老化と紡錘体形成機構の解析：E18.5マウス肺と実験(2)のE14.5マウス肺を用い、ミトコンドリア形態を電験で、機能を細胞外フラックスアナライザーで、調節分子をPGC-1α/-1β発現で解析する。紡錘体形成能について、単離前駆細胞を用いα-tubulinとγ-tubulinの二重免疫染色で解析する。紡錘体チェックポイント分子動態を定量PCRで、染色体コングレッション制御分子EG5のリン酸化をwestern blottingにて解析する。

次年度使用額が生じた理由

PDGFRα陽性細胞標識マウスの動物実験計画書の承認が2019年5月となったため。次年度に次年度使用額を合わせてPDGFRα陽性細胞標識マウスを購入する。

研究成果

• [雑誌論文] Impaired adaptation of energy intake induces severe obesity in aged mice on a high-fat diet (2019)
  • 著者名/発表者名: Okada Tadashi、Mita Yuichiro、Sakoda Hideyuki、Nakazato Masamitsu
  • 雑誌名: Physiological Reports 巻: 7 ページ: e13989～e13989
  • DOI: 10.14814/phy2.13989
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The Homeostatic Force of Ghrelin (2018)
  • 著者名/発表者名: Yanagi Shigehisa、Sato Takahiro、Kangawa Kenji、Nakazato Masamitsu
  • 雑誌名: Cell Metabolism 巻: 27 ページ: 786～804
  • DOI: 10.1016/j.cmet.2018.02.008
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Metformin treatment ameliorates diabetes-associated decline in hippocampal neurogenesis and memory via phosphorylation of insulin receptor substrate 1 (2018)
  • 著者名/発表者名: Tanokashira Daisuke、Kurata Eiko、Fukuokaya Wataru、Kawabe Kenshiro、Kashiwada Mana、Takeuchi Hideyuki、Nakazato Masamitsu、Taguchi Akiko
  • 雑誌名: FEBS Open Bio 巻: 8 ページ: 1104～1118
  • DOI: 10.1002/2211-5463.12436
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Activation of AMPK-Regulated CRH Neurons in the PVH is Sufficient and Necessary to Induce Dietary Preference for Carbohydrate over Fat (2018)
  • 著者名/発表者名: Okamoto S, Sato T, Tateyama M, Kageyama H, Maejima Y, Nakata M, Hirako S, Matsuo T, Kyaw S, Shiuchi T, Toda C, Sedbazar U, Saito K, Asgar NF, Zhang B, Yokota S, Kobayashi K, Foufelle F, Ferre P, Nakazato M, Masuzaki H, Shioda S, Yada T, Kahm BB, Minokoshi Y.
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 22 ページ: 706～721
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2017.11.102
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Analysis of peripheral ghrelin signaling via the vagus nerve in ghrelin receptor?restored GHSR-null mice (2018)
  • 著者名/発表者名: Okada Tadashi、Waise T.M. Zaved、Toshinai Koji、Mita Yuichiro、Sakoda Hideyuki、Nakazato Masamitsu
  • 雑誌名: Neuroscience Letters 巻: 681 ページ: 50～55
  • DOI: 10.1016/j.neulet.2018.05.035
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Single cell analyses on vagal nodose ganglion neurons verify functional interaction of feeding-regulatory gut peptides. (2019)
  • 著者名/発表者名: Nakazato M.
  • 学会等名: Cell Symposia「Single Cells: Technology to Biology」
  • 国際学会
• [学会発表] Development of Diagnostic Biomarkers of Lung Neuroendocrine Tumors by the Detection of Cancer-Derived Protein Fragments in the Urine Using Original Mass Spectrometric Methods. (2019)
  • 著者名/発表者名: Nakazato M.
  • 学会等名: 16h Annual ENETS Conference
• [学会発表] 近代の神経内分泌の歴史 (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakazato M
  • 学会等名: ICN
  • 国際学会 / 招待講演