| 研究課題/領域番号 |
18K19579
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
宮川 周士 大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (90273648)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2021-03-31
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| キーワード | PERV / CRISPR / ブタ線維芽細胞 |
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| 研究実績の概要 |
ブタを足場としてヒトの臓器を作らせる再生医療、およびバイオ人工臓器の開発には、今もブタ内在性レトロウイルス（PERV）が大きな問題になっている。目的はPERV感染の無い、あるいは殆ど無いブタを作る事である。
Knockdown(KD)の方法には、ZFN法、TALEM法、CRISPR/Cas9法が知られている。このうちCRISPR/Cas9法は非常に簡便で、既にUSA/Chinaの会社がこの方法でPERVのKOに成功したことを報告している。しかし、CRISPR/Cas9法自体はその特許が世界的に問題となり、多くのベンチャーグループはこれを使うことを回避している。我々も他の方法を開発し、PERVのKOに望むことを検討した。
まずは、新しいCRISPR法を検定すべく、既に過去ブタの細胞やブタ個体でKOをかけた経験のあるalpha-Gal転換酵素(a-GalT)遺伝子のKOから試みることにした。その機能ドメインである Exon9をtargetに５‘側に一箇所、３’側に一箇所siteを設定し、同じくU6のpromoterに組み込み、ブタ線維芽細胞を用いて、新しいCRISPR法でa-GalTのKOを試みた。しかし、細胞に対する毒性が強く、a-Galの発現の低下は認めたものの、細胞の状態が悪化し、クローン化に既に何度も失敗している。また、遺伝子導入が比較的容易な血管内皮でも試みたが同じく細胞障害性が強く、現時点でもクローン化に成功していない状態である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
新しいCRISPR法の検定の困難性
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| 今後の研究の推進方策 |
新しいCRISPR法を応用して、PERVのKOに取り込む。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今回のPERVの制御に、当初CRISPR/Cas9法を予定していたが、社会的理由、つまりその特許が世界的に問題となり、多くのグループはこれを使うことを回避している状態であることが判明した。従って、我々も他の方法を用いて、PERVのknockoutに望むことを検討している。
まずはブタ線維芽細胞を用いて、新しい法でKOを試みたが、細胞に対する毒性が強く、 KO効果は多少認めたものの、細胞の状態が悪化し、クローン化に既に何度も失敗している状態である。そのため、研究が一時的に中断し遅れている。
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