ブタを足場としての再生医療とバイオ臓器の開発における内在性レトロウイルスの制御

2020 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19579
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 宮川 周士 大阪大学, 微生物病研究所, 招へい研究員 (90273648)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2021-03-31
• キーワード: PERV-C / CRISPR/Cas3 / ブタ繊維芽細胞

研究実績の概要

ブタを臓器発生の足場として使う再生医療やバイオ人工臓器（異種移植）の開発が進んでいる一方で、未だブタ内在性レトロウイルス（PERV）の問題が取り沙汰され続けている。今回の研究の大きくは、ヒトへのPERV感染の可能性の少ないブタを作る事にある。我々は特許が問題視されているCRISPR/Cas9法を避けて、日本独自の遺伝子Knockout法であるCRISPR/Cas3法を用いてこのブタ作りをする事にしている。
既にブタGal-T(GGTA1)に対するknockout(KO)に関しては、CRISPR/Cas3法にて一定の成果を治めている。また、昨年度末までにブタのCHAMやDol-P-mannosidase用のCas3-crRNAを作出している。今回、次のステップとして、PERV-Cの遺伝子について直接KOを試みた。まずはA/Cキメラを検討し、多くの論文より、PERV-A部位は常にenb領域の５‘側にあり、反対にPERV-Cの部位はTM側であることを確かめた。そこで、envのstop codonの位置から上流へ向けたCRISPRのsite部位を設定しpBS-U6-crRNAを作り、これとBPNLS-hCas3およびtk-Neoを融合したplasmidを作り出した。そしてpX-Cascadeと同時にブタの繊維芽細胞に遺伝子導入をこころみた。PCR検査でその効果を確かめている。
また現在、ヒトの細胞へのPERV-C(A/C)の感染実験を、以前はPERV-BによるLacZ-Pseudotype assay法で行ってきたが、PCR検定による方法で整備している。また、PERVを自然に放出しているPK-15細胞 (ブタ腎癌由来) が検査の結果PERV-C freeであることが判明したため、通常の繊維芽細胞を検定に用いる事にした。

研究成果

• [雑誌論文] Human CD200 Suppresses the HL-60 Mediated Xenocytotoxicity (2020)
  • 著者名/発表者名: Eguchi Hiroshi、Maeda Akira、Matsuura Rei、Shabri Afifah Mod、Lo Pei-Chi、Kodama Tasuku、Noguchi Yuki、Yoneyama Tomohisa、Toyama Chiyoshi、Tazuke Yuko、Okuyama Hiroomi、Miyagawa Shuji
  • 雑誌名: Transplantation Proceedings 巻: 52 ページ: 1910～1912
  • DOI: 10.1016/j.transproceed.2020.01.141
  • 査読あり
• [雑誌論文] Human CD31 on Swine Endothelial Cells Induces SHP-1 Phosphorylation in Macrophages (2020)
  • 著者名/発表者名: Noguchi Yuki、Maeda Akira、Wang Han-Tang、Takakura Chihiro、Lo Pei-Chi、Kodama Tasuku、Yoneyama Tomohisa、Toyama Chiyoshi、Eguchi Hiroshi、Okuyama Hiroomi、Miyagawa Shuji
  • 雑誌名: Transplantation Proceedings 巻: 52 ページ: 1913～1915
  • DOI: 10.1016/j.transproceed.2020.01.140
  • 査読あり
• [雑誌論文] Reactions to Porcine Cells With or Without β4GalNT2 (2020)
  • 著者名/発表者名: Lo Pei-Chi、Eguchi Hiroshi、Sakai Rieko、Maeda Akira、Kogata Shuhei、Toyama Chiyoshi、Yoneyama Tomohisa、Ueno Takehisa、Tazuke Yuko、Watababe Masahito、Nagashima Hiroshi、Ikawa Masahiko、Okuyama Hiroomi、Miyagawa Shuji
  • 雑誌名: Transplantation Proceedings 巻: 52 ページ: 1916～1918
  • DOI: 10.1016/j.transproceed.2020.01.154
  • 査読あり
• [学会発表] The effect of a PAK-2 inhibitor on macrophage differentiation/polarization in a rat small intestinal transplantation model (2020)
  • 著者名/発表者名: Tasuku Kodama, Akira Maeda, Pei-Chi Lo, Takehisa Ueno, Yuko Tazuke, Hiroshi Eguchi, Katsuyoshi Matsunam, Shuji Miyagawa, Hiroomi Okuyama
  • 学会等名: The Transplantation Society
  • 国際学会
• [学会発表] CD177 on swine cells suppresses xenogeneic macrophage-mediated cytotoxicity (2020)
  • 著者名/発表者名: Pei-Chi Lo, Akira Maeda, Toshihisa Yoneyama, Chiyoshi Toyama, Shuhei Kogata, Chizu Okamatsu, Masahito Watanabe, Hiroshi Nagashima, Hiroshi Eguchi, Hiroomi Okuyama, Shuji Miyagawa
  • 学会等名: The Transplantation Society
  • 国際学会