| 研究課題/領域番号 |
18K19603
|
|---|
| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
|---|
研究代表者 |
淺原 弘嗣 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (70294460)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2021-03-31
|
| キーワード | 筋分化 / DNAメチル化 / DNMT3A / Rp58 / ES細胞 |
|---|
| 研究実績の概要 |
i) マウス個体レベルでのDNAメチル化誘導領域の解析：Rp58とDnmt3aの筋分化におけるDNA結合部位を、時間軸にそって明らかにするため、DNMT3AおよびRp58の5’にＨＡタグをCRISPR/Cas9を用いてタグをノックインしたマウス個体を作成した。これら遺伝子改変マウス作成に成功していることをゲノムシークエンスで確認し、ウエスタンブロッティングによって、タンパクの発現を確認した。まだ、オフターゲットの可能性についても吟味した。作成されたマウスから、必要十分なマウス個体数を得た。この遺伝子改変マウスを用いることで、Rp58 とDNMT3Aの筋分化におけるゲノムワイドな局在解析を筋組織を用いて行うことが可能となった。予備実験として、Rp58とDnmt3a それぞれのタグをノックインした個体より、それぞれのE12.5, E13.5, E14.5の筋組織を用いてChIPを行い、DNMT3AとRp58とDNAの複合体が十分量濃縮できることを確認した。同時に、筋組織のトランスクリプトーム解析を、RNA-Seq手法を用いて解析、筋分化における遺伝子発現の基盤情報を得た。
ii)マウスES細胞を用いたHox遺伝子座におけるRp58結合領域のDNAメチル化への影響：マウスES細胞からの筋分化の系において、Rp58のリクルートとde novo DNAメチル化のタイミングを時系列で解析、更に、Rp58結合サイトに、dCas9をリクルートすることでRp58の結合を阻害させた時のDNAメチル化および遺伝子の発現、更に筋分化への影響を検討した。この時、ヒストンの修飾マーカーもChIP-seqによって解析し、ヒストン修飾とDNAメチル化の関係についても検証した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度においては、研究進捗において、律速段階となっていた、Rp58ノックアウトマウスの解析が進み、そのフェノタイプとDNAメチル化状態の解析が進捗した。ES細胞を用いた研究計画については、マウス個体から得られる情報との一致性を確認することに時間を要している。
|
| 今後の研究の推進方策 |
de novo DNAメチル化は、多くが初期発生期におこり、組織特異的なde novo DNAメチル化領域は比較的限局されていると考えられている。Rp58のコンディショナルノックアウトマウス（Rp58CKO；Rp58fl/fl）を、筋細胞特異的なCreマウスと交配させたところ、この遺伝子改変マウス（Myogeni-Cre；Rp58fl/fl）では、筋組織の分化が著しく阻害されていることが本研究において確認されており、本年度は、更に、このCKOマウスの異常筋組織の詳細な解析をRNAの網羅的シークエンスによるトランスクリプトーム解析などの手法を用いて行う。また、筋特異的なDNMT3Aのノックアウトマウスと、Rp58ノックアウトマウスの筋組織のフェノタイプを比較検討し、発生時期特異的な遺伝子発現ネットワークの差異とともに、筋組織におけるde novo DNAメチル化部位を解析、de novo DNAメチル化とRp58結合サイトとの関連を検討する。
さらに、Rp58とDnmt3aの筋分化におけるDNA結合部位を、時間軸にそって明らかにするため、タグをノックインしたマウス個体を作成し、個体から得られる、筋発生分化の各ステージにおけるクロマチン免疫沈降および次世代シークエンサーを用いた解析を行うことで、Rp58とDnmt3aそれぞれのDNA結合様式を検討する。さらに、Rp58とDnmt3aの共免疫沈降を行い、これら分子の結合様式を詳細に解析する。以上の研究情報をもとに、ラブドミオザルコーマなどの筋由来の軟部肉腫において、Hox遺伝子座のメチル化やRp58の臨床検体の解析にむけた情報収集を行い、研究の更なる継続に向けた検討を行う。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）遺伝子改変マウスの作成の一部が当初計画よりも遅れ、実験に使用可能なマウスを得ることができなかった。
結果として本年度実験可能であったマウス数は予定より少なくなり、また同マウスを用いて行う予定であった実験が行えなかったことにより、予定通りの予算執行ができなかった。
（使用計画）次年度においては計画していた全ての遺伝子改変マウスが作成できる予定のため、これを飼育・繁殖させ、十分な数の同マウスを用いた実験、およびそれを用いた分子生物学的実験に必要な試購入のために使用する。
|
