| 研究課題/領域番号 |
18K19609
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
大森 孝一 京都大学, 医学研究科, 教授 (10233272)
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| 研究分担者 |
山下 勝 京都大学, 医学研究科, 客員研究員 (10635519)
楯谷 一郎 京都大学, 医学研究科, 講師 (20526363)
中村 亮介 京都大学, 医学研究科, 研究員 (40736708)
岸本 曜 京都大学, 医学研究科, 特定病院助教 (80700517)
青山 朋樹 京都大学, 医学研究科, 教授 (90378886)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2020-03-31
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| キーワード | 声帯 / 培養 / 上皮細胞 / 線維芽細胞 |
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| 研究実績の概要 |
声帯組織の3次元構造を作製するためには、組織を構成するそれぞれの細胞の培養基盤技術の確立が不可欠となる。粘膜固有層を構成する線維芽細胞に関しては、組織片培養により初代培養可能であることが確認されている。そこで、まずは声帯上皮細胞の分離培養技術の確立を行った。
ラットの喉頭を採取し, 酵素処理を行うことにより声帯上皮細胞と粘膜下の線維芽細胞を分離し培養したところ、培養開始から1週間程度で70％コンフルエントに達しセルカルチャーインサートに継代培養を行うことが可能であった。
続いて、培養している細胞が上皮として十分な機能を保持しているか確認するため, その重層化構造やタイトジャンクション構成蛋白の発現、バリア機能の有無について検討した。電子顕微鏡による観察では重層化した上皮細胞が観察された。また免疫細胞化学でタイトジャンクション構成蛋白であるOccludin、ZO-1、claudinの発現と敷石状の細胞骨格を確認することができた。更に、バリア機能を評価するため、線維芽細胞を培養した細胞シートとの比較を行ったところ、上皮細胞を培養したものでは継代後6日目以降のtransepithelial electrical resistance(TEER)は2000Ω*cm2前後で推移し、前後線維芽細胞シートと比較し有意に高値であった。
以上より、ラット声帯上皮細胞の培養技術が確立され、培養細胞はタイトジャンクションやバリア機能に関して上皮細胞としての機能が維持されていることが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
分離培養技術の条件検討に時間を要したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
①今後、早急にラット声帯筋細胞の分離培養基盤技術を確立する。その上で、これらの分離培養技術をイヌに応用し、イヌ声帯上皮細胞、筋細胞の分離培養を行う。
②培養上皮細胞、筋細胞と声帯線維芽細胞を組み合わせることにより声帯組織の3次元構造の再現を試みる。
③作製した3次元声帯組織を用いて、イヌ声帯欠損部への移植実験を行い、その生着を確認するとともに、組織学的、機能的検証を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
培養技術の確立に時間を要したため。次年度の3次元培養で用いる試薬の購入に使用する予定。
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