| 研究課題/領域番号 |
18K19616
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
不二門 尚 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 特任教授 (50243233)
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| 研究分担者 |
三橋 俊文 帝京大学, 医療技術学部, 教授 (20506266)
三好 智満 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (70314309)
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| 研究期間 (年度) |
2018-06-29 – 2023-03-31
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| キーワード | 網膜イメージング / 軸索 / 樹状突起 / GFP / Thy-1プロモーター / GCaMP |
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| 研究実績の概要 |
2018年度の研究で小型簡易蛍光顕微鏡による生体ラットの視神経細胞及び軸索・樹状突起の観察が、Thy-1プロモーターによってGFPを発現したラットで可能であることを10倍程度の低倍率観察で確認した。そこで2019年度前半に、in vivo眼底観察としては高倍率となる20倍と40倍の観察を行った。これまで他の方法ではin vivo観察ができなかった神経節細胞の軸索および樹状突起等の網膜内構造を、観察できることを示すことができた。低倍率での観察と同様、GFPでは逆行性染色よりも細胞全体が強く染色されることが分かった。また、動物のイメージング前の染色のための手術侵襲が無いこともメリットである。本研究では、角膜と水晶体を除去し、収差の発生を抑えることにより軸索・樹状突起の観察を可能にしたが、問題点として、角膜と水晶体の除去による侵襲で網膜剥離が頻発することが挙げられる。従来カバーガラスの使用で網膜剥離を抑えて来たが、網膜が剥離し観察野に傾斜が付いてしまうことが多かった。水晶体の除去が特に問題と思われ、理想は白内障手術のような超音波を使った術式と思われた。2019年の研究後半では対策として、硝子体の代わりにagarを充填する、あるいは除去した角膜部分に眼圧を維持する目的で窓付きプラグを導入し、プラグの場合には大きな剥離が起こるまでの時間を延ばすことができた。細胞の活性をin vivo観察するため、カルシウム濃度に応じて蛍光強度が変化するGCaMPの遺伝子導入ラットの作成の準備を進めた。2020年度および2021年度は、コロナ禍で共同研究者の来阪がかなわず、大きな進捗はなかったが、来阪が可能となった2022年度後半にGCaMP導入ラットの電気刺激中の蛍光イメージングを試みたが，蛍光の発光が認められなかった。
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