自殺遺伝子CD-UPRTゲノム編集iPS細胞を用いた遺伝子治療

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 18K19622
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 戸田 正博 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (20217508)
• 研究期間 (年度): 2018-06-29 – 2021-03-31
• キーワード: 自殺遺伝子 / iPS / 神経幹細胞

研究実績の概要

悪性グリオーマが極めて治療困難な要因は、腫瘍幹細胞 (BTSC) が正常脳組織へ浸潤する性質を有することである。一方、神経幹細胞(NSC)は、脳内を遊走し脳腫瘍へ集積する性質を有することから、治療遺伝子を搭載する細胞としての役割が注目されている。そこで本研究では、治療困難な浸潤性BTSCの根絶を目指してiPSから分化誘導したNSCを用いた自殺遺伝子細胞治療の開発を行う。導入する自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ（CD）とUPRT遺伝子の組み合わせを用いる。CDは5-fluorocytosine（5-FC）を 5-fluorouracil（5-FU）に変換し、DNAおよびRNA合成を抑制して細胞死へ誘導する。さらにUPRTは5-FU を thymidylate synthase 阻害剤 である5-FUMP へ変換するため、CD 単独と比べ 100倍以上の bystander effect （周辺腫瘍細胞を細胞死へ誘導する）が得られる。
本年度は、自殺遺伝子を組み込んだiPS細胞の作成を行った。iPS細胞は、安全性が確認されたintegration-freeのヒトiPS細胞株を用いて、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて、GAPDH領域にCD-UPRT自殺遺伝子を挿入した。具体的には、GAPDHとhKO1(赤色蛍光タンパク質)とを2A peptide配列で連結し、CD-UPRT発現ユニットが逆方向に挿入される相同組み換え用コンストラクトを作製した。相同組み換えiPS細胞をhKO1発現により選択し、genomic sequencingにより確認した。以上、本年度はCD-UPRTを安定発現するiPS細胞株を樹立した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ゲノム編集技術（CRISPR/Cas9システム）を利用して、iPS細胞のGAPDH領域にCD-UPRT遺伝子挿入した。CD-UPRTを安定発現するiPS細胞の作成に成功し、NSCへの分化誘導を確認した。本年度の目標はおおむね達成することができた。

今後の研究の推進方策

1. CD-UPRT-iPS由来NSCを用いたin vitroでのBTSC殺傷効果の解析
CD-UPRT発現細胞は、5-FCを投与すると、CDが5-FCを5-FUに変換し、UPRT が5-FU をthymidylate synthase 阻害剤の 5-FUMP へ変換するため、周辺の腫瘍細胞を細胞死へ誘導する。ゲノム編集操作により得られたCD-UPRT-iPSをNSCへ分化誘導後、in vitroでのヒトBTSCに対するbystander effectを検証する。
2. 脳スライス培養におけるCD-UPRT-iPS由来NSCのBTSC殺傷効果の解析
ヒトBTSCモデルマウスにCD-UPRT-NSCを移植後、脳切片を作成し、共焦点レーザー顕微鏡のCO2チャンバー内で5-FC投与下培養し、BTSC殺傷効果、NSC移動能をtime-lapse撮影により解析する。我々はすでにslice培養上でiPS由来NSCを5日間観察することに成功している。

次年度使用額が生じた理由

（理由）効果的に物品調達を行った結果であり、次年度の研究費と合わせて試薬・消耗品などの購入に充てる予定である。
（使用計画）次年度は、自殺遺伝子細胞療法のin vitro効果解析に重点を置くため、幹細胞培養、スライス培養のイメージング解析が主体となる。培養関連試薬、イメージング解析の関連試薬、組織解析の関連試薬を中心に購入予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Predictive markers for MGMT promoter methylation in glioblastomas. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kanazawa T, Minami Y, Jinzaki M, Toda M, Yoshida K, Sasaki H.
  • 雑誌名: Neurosurgical Review 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1007/s10143-018-01061-5.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Increased Cytotoxicity of Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells. (2019)
  • 著者名/発表者名: Iwasawa C, Tamura R , Sugiura Y, Suzuki S, Kuzumaki N , Narita M , Suematsu M , Nakamura M , Yoshida K , Toda M , Okano H, Miyoshi H.
  • 雑誌名: International journal of molecular sciences 巻: 20 ページ: 810-810
  • DOI: 10.3390/ijms20040810
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A pilot study of vaccine therapy with multiple glioma oncoantigen/glioma angiogenesis-associated antigen peptides for patients with recurrent/progressive high-grade glioma. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kikuchi R, Ueda R, Saito K, Shibao S, Nagashima H, Tamura R, Morimoto Y, Sasaki H, Noji S, Kawakami Y, Yoshida K, Toda M
  • 雑誌名: Journal of clinical medicine 巻: 8 ページ: 263
  • DOI: 10.3390/jcm8020263.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] PITX2 Expression in Non-functional Pituitary Neuroendocrine Tumor with Cavernous Sinus Invasion. (2019)
  • 著者名/発表者名: Tamura R, Ohara K, Morimoto Y, Kosugi K, Oishi Y, Sato M, Yoshida K, Toda M
  • 雑誌名: Endocrine pathology 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1007/s12022-019-9573-8.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Bridging vein and tentorial sinus in the subtemporal corridor during the anterior transpetrosal approach. (2019)
  • 著者名/発表者名: Shibao S, Toda M, Fujiwara H, Jinzaki M, Yoshida K
  • 雑誌名: Acta Neurochirurgica 巻: 161 ページ: 821-829
  • DOI: 10.1007/s00701-019-03857-w.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Difference in immunosuppressive cells between the peritumoral area and tumor core in glioblastoma. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tamura R, Ohara K, Sasaki H, Morimoto Y, Kosugi K, Yoshida K, Toda M
  • 雑誌名: World Neurosurgery 巻: 120 ページ: 601-610
  • DOI: 10.1016/j.wneu.2018.08.133.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Preoperative prediction of solitary fibrous tumor/hemangiopericytoma and angiomatous meningioma using magnetic resonance imaging texture analysis. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kanazawa T, Minami Y, Jinzaki M, Toda M, Yoshida K, Sasaki H
  • 雑誌名: World Neurosurgery 巻: 120 ページ: 1208-1216
  • DOI: 10.1016/j.wneu.2018.09.044.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Treatment strategy for tuberculum sellae meningiomas based on a preoperative radiological assessment. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kuga D, Toda M, Yoshida K
  • 雑誌名: World Neurosurgery 巻: 120 ページ: 1279-1288
  • DOI: 10.1016/j.wneu.2018.09.054.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Skull base venous anatomy associated with endoscopic skull base neurosurgery: a literature review (2018)
  • 著者名/発表者名: Mizutani K, Akiyama T, Yoshida K, Toda M
  • 雑誌名: World Neurosurgery 巻: 120 ページ: 405-414
  • DOI: 10.1016/j.wneu.2018.09.067.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Endoscopic endonasal approach combined with a simultaneous transcranial approach for giant pituitary tumors. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kuga D, Toda M, Ozawa H, Ogawa K, Yoshida K
  • 雑誌名: World Neurosurgery 巻: 121 ページ: 173-179
  • DOI: 10.1016/j.wneu.2018.10.047.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] ゲノム編集iPS細胞を用いた悪性神経膠腫に対する自殺遺伝子治療 (2018)
  • 著者名/発表者名: 田村亮太、戸田正博、三好浩之、岩澤千鶴、森本佑紀奈、オルテア サンペトラ、佐谷秀行、岡野栄之、吉田一成
  • 学会等名: 第36回日本脳腫瘍学会学術集会